该成果以“Flammulina velutipes polysaccharide exerts immunomodulatory function involving RSAD2 to regulate the NF-κB/MAPK signaling pathway in RAW264.7 macrophage cells and in mouse spleen cells”为题发表在中科院 TOP 期刊International Journal of Biological Macromolecules杂志（IF 7.7）
Introduction
免疫系统被称为机体的“卫士”，保护身体免受环境的有害影响，其主要功能是维持体内平衡。免疫系统由免疫器官、免疫组织、免疫细胞和免疫活性物质共同作用。多糖因其来源广泛、获取便利、成本低廉、无毒无害、性质稳定、可生物降解且具有生物相容性，已被研究作为潜在的免疫系统增强剂。已有研究表明，多糖类物质可通过激活免疫细胞、促进其吞噬作用、增强相关细胞因子或信号分子的分泌以及刺激细胞有丝分裂来发挥免疫调节功能。
金针菇具有丰富且显著的营养健康价值。我们的研究团队之前已经证实，金针菇多糖表现出显著的免疫调节活性。具体来说，在环磷酰胺（CTX）诱导的免疫抑制小鼠模型中，发现金针菇多糖（FVP-1）可有效恢复胸腺和脾脏指数，还可以增强了抗氧化能力并调节免疫相关因子的水平。
根据小鼠脾脏蛋白质组学结果可知，金针菇多糖在体内发挥的免疫调节作用可能与相关免疫细胞的功能调控和抗原呈递相关，与差异蛋白RSAD2关系密切。RSAD2（自由基s-腺苷蛋氨酸结构域蛋白），也称Viperin蛋白，这种蛋白是一种参与先天免疫的干扰素刺激蛋白，可能与金针菇多糖在体内的免疫调节作用密切相关。先前的研究还揭示了RSAD2与经典核因子kappa B（NF-κB）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路之间的潜在关系。发现NF-κB 通路能够通过IRF1 和PRDI-BF1 等蛋白调节RSAD2 的变化，且RSAD2还被报道通过ddhCTP、GATA3、PKC-θ、IRAK1、TAK1等调控NF-κB和MAPK/AP-1通路。然而，RSAD2 在FVP-1 免疫调节功能中的特定作用及其潜在机制仍不清楚，且该调控机制与NF-κB/MAPK信号通路的关系仍有待阐明。本研究在细胞水平上对这些知识空白进行了探索，同时考察了FVP-1对T淋巴细胞成熟与转化的影响。因此，本研究采用小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系及从小鼠体内采集的脾脏细胞作为实验材料。
图1：FVP-1多糖发挥免疫调节作用的机制
Results and Discussion
一、FVP-1对RAW264.7细胞的免疫调节作用
巨噬细胞RAW264.7参与了许多免疫过程，在先天免疫和获得性免疫中均发挥重要作用。首先，经过MTT实验，选定200、400和800μg/mL为后续实验的给药剂量（图2 A）。同时，在巨噬细胞RAW264.7中，吞噬活性的增强在一定程度上意味着机体防御能力的提升，因此我们对中性红摄取情况进行检测，发现经LPS（P < 0.05）和FVP-1（200、400及800 μg/mL）处理的RAW264.7细胞吞噬能力均显著增强且与FVP-1浓度呈正相关（图2 B）。细胞因子是诱导和调节免疫反应、介导细胞间通讯的重要信号分子，在维持机体稳态中发挥关键作用。本研究通过ELISA和RT-PCR技术可知，阳性对照组以及不同浓度FVP-1（200、400、800 μg/mL）均能显著促进TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌及相应mRNA的表达。（图2 C-H）。活性氧（ROS）是巨噬细胞及巨噬细胞介导免疫的核心要素。经过对细胞中ROS含量的检测，阳性对照组（LPS处理）和实验组（FVP-1处理）的荧光峰均出现显著右移（图2 I-M）。定量分析显示相对荧光强度存在显著差异（图2 N），证实了FVP-1具有免疫调节功能。
图2：(A) FVP-1对巨噬细胞RAW264.7细胞活性的影响。(B) FVP-1对RAW264.7细胞吞噬活性的影响。(C–H) FVP-1对RAW264.7细胞中TNF-α(C)、IL-6(D)和IL-1β(E)分泌及mRNA表达(F–H)的影响。(I–N)不同组别细胞ROS荧光强度(I-M)及相对荧光强度分析(N)。
二、FVP-1对巨噬细胞中RSAD2等关键蛋白的调控作用
当巨噬细胞受到刺激时，可诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的合成与环氧合酶-2（COX-2）的分泌会被促进。iNOS是巨噬细胞炎症反应中的关键酶，而COX-2则是在炎症和免疫应答过程中负责前列腺素（PGs）合成的诱导酶。结果显示：与空白对照组相比，阳性对照组（LPS处理）和实验组（FVP-1处理）的RAW264.7细胞中iNOS与COX-2 mRNA及蛋白表达均出现显著提升（图3 A-D）。NF-κB能调控先天性和适应性免疫功能的多个方面，以及参与免疫和炎症反应的基因表达，MAPK参与从先天性免疫启动到适应性免疫激活等免疫反应的各个环节。Western印迹分析结果表明，FVP-1的处理能显著提高p-P65、p-IκB-α、p-P38、p-ERK和p-JNK的表达水平，但对这些蛋白的非磷酸化形式没有影响（图3 E-H）。这些结果表明FVP-1通过激活RAW264.7细胞中的NF-κB和MAPK信号通路发挥免疫调节作用。我们还通过WB和RT-PCR技术分别检测了RSAD2的蛋白水平与mRNA水平表达。LPS或FVP-1（200、400及800 μg/mL浓度）均能显著上调巨噬细胞中RSAD2的mRNA表达水平。同时，RSAD2的蛋白表达水平也呈现显著上调（P < 0.001）（图3 I-K），这一趋势与NF-κB/MAPK信号通路及免疫细胞因子分泌的变化相一致。
图3：(A) COX-2 mRNA表达水平。(B) iNOS mRNA表达水平。(C) RAW264.7细胞中COX-2和iNOS的蛋白质印迹分析。(D) COX-2和iNOS蛋白的定量分析。(E) RAW264.7细胞中P65、p-P65、IκB-α和p-IκB-α的蛋白质印迹分析。(F) P65、p-P65、IκB-α和p-IκB-α蛋白的定量分析。(G) RAW264.7细胞中P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK和p-JNK的蛋白质印迹分析。(H) P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK和p-JNK蛋白的定量分析。(I) RSAD2 mRNA表达水平。(J) RAW264.7细胞中RSAD2的蛋白质印迹分析。(K) RSAD2蛋白的定量分析
三、RSAD2在巨噬细胞中FVP-1免疫作用中的功能
通过瞬时转染RSAD2 siRNA和过表达质粒，研究RSAD2蛋白敲低及过表达后免疫相关细胞因子、信号分子以及NF-κB/MAPK信号通路的变化。结果表明：RSAD2 siRNA能成功敲低RAW264.7细胞中RSAD2的表达（图4 A-C）；RSAD2过表达质粒可促进RSAD2 mRNA和蛋白的表达（图5 A-C）。相较于单独使用FVP-1处理，敲除RSAD2后再用FVP-1处理会削弱FVP-1促进TNF-α、IL-6和IL-1β分泌的能力，并降低相应mRNA的表达水平（图4 D-I）；当仅使用RSAD2过表达质粒时，TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量及相应mRNA表达水平均显著增加（图5 D-I）。转染RSAD2 siRNA后，与单独使用FVP-1相比，FVP-1促进iNOS和COX-2 mRNA及蛋白表达的能力被显著抑制（图4 J-M）；OE RSAD2组中iNOS和COX-2的mRNA及蛋白表达水平显著升高（图5 J-M）。敲低RSAD2后，FVP-1促进p65、IκB、p38、ERK和JNK磷酸化的能力显著降低，而相应非磷酸化蛋白的表达水平保持不变（图4 N-Q）；转染RSAD2过表达质粒后，p65、IκB、p38、ERK和JNK的磷酸化水平显著高于Vector组，相应非磷酸化蛋白的表达水平仍无变化（图5 N-Q）。可见，差异蛋白RSAD2调控了NF-κB/MAPK信号通路，并参与了金针菇多糖FVP-1对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节过程。
图4：(A) RSAD2 mRNA表达水平；(B) RSAD2蛋白免疫印迹分析；(C) RSAD2蛋白定量分析；(D–I) RSAD2转染对细胞因子分泌(D–F)及mRNA表达(G-I)的影响；(J) COX-2 mRNA表达水平；(K) iNOS mRNA表达水平；(L) COX-2和iNOS蛋白免疫印迹分析；(M) COX-2与iNOS蛋白定量分析；(N) P65、p-P65、IκB-α及p-IκB-α蛋白免疫印迹分析；(O) P65、p-P65、IκB-α和p-IκB-α定量分析；(P) P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK及p-JNK蛋白免疫印迹分析；(Q) P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK和p-JNK蛋白定量分析。
图5：(A) RSAD2 mRNA表达水平；(B) RSAD2蛋白质印迹分析；(C) RSAD2蛋白定量分析；(D–I) RSAD2转染对细胞因子分泌(D–F)及mRNA表达(G-I)的影响；(J) COX-2 mRNA表达水平；(K) iNOS mRNA表达水平；(L) COX-2与iNOS蛋白质印迹分析；(M) COX-2和iNOS蛋白定量分析；(N) P65、p-P65、IκB-α及p-IκB-α蛋白质印迹分析；(O) P65、p-P65、IκB-α和p-IκB-α定量分析；(P) P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK及p-JNK蛋白质印迹分析；(Q) P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK和p-JNK蛋白定量分析。
四、FVP-1对小鼠脾细胞的免疫调节作用
通过蛋白质组学技术，我们研究团队先前发现小鼠脾脏组织在FVP刺激后存在RSAD2蛋白的过度表达，因此，研究FVP-1对脾细胞的作用将为RSAD2的功能提供更多见解。经过MTT实验，选定200、400和800μg/mL为后续脾细胞实验的浓度梯度（图6 A）。通过ELISA和RT-PCR技术可知，与空白对照组相比，阳性对照组（LPS组）及FVP-1处理组（200、400和800 μg/mL）显著促进了小鼠脾细胞中细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌及其对应mRNA的表达（图6 B-G）,以及iNOS和COX-2的mRNA表达及蛋白表达均显著增强（图6 H-K）。
图6：(A) FVP-1对小鼠脾脏细胞中巨噬细胞活性的影响。FVP-1对小鼠脾脏细胞中TNF-α（B）、IL-6（C）和IL-1β（D）分泌及mRNA表达（E-G）的影响。(H) COX-2 mRNA表达水平。(I) iNOS mRNA表达水平。(J) 小鼠脾脏细胞中COX-2和iNOS的蛋白质印迹分析。(K) COX-2蛋白和iNOS蛋白的定量分析。
同时检测了FVP-1对脾细胞中NF-κB和MAPK信号通路的影响，结果可知，200、400和800 μg/mL的FVP-1处理显著提高了P65、IκB-α、P38、ERK和JNK的磷酸化表达水平，但未影响非磷酸化形式的表达水平（图7 A-D）。RSAD2蛋白及相应mRNA的表达水平小鼠脾细胞中RSAD2的蛋白表达水平与mRNA表达水平均显著升高（图7 E-G）。该结果与前述NF-κB/MAPK信号通路中细胞因子及相关蛋白的表达情况相符，由此可见，RSAD2也参与了FVP-1在小鼠脾细胞中的免疫调节作用。淋巴细胞由功能与蛋白质产物各异的多个亚群组成，研究采用CD3/别藻蓝蛋白(APC)、CD4/藻红蛋白（PE）和CD8/异硫氰酸荧光素（FITC）三色流式细胞术标记细胞，分析了FVP-1作用下淋巴细胞亚群的变化。与空白对照组相比，不同浓度FVP-1处理均显著增加了CD3+T细胞数量及CD4+/CD8+比值，且呈现浓度依赖性增强趋势。结果表明，FVP-1可促进小鼠脾细胞中T淋巴细胞成熟并增强机体免疫功能，且这种促进/增强效应随FVP-1浓度升高而增强（图7 H-M）。
图7：(A) 小鼠脾细胞中P65、p-P65、IκB-α及p-IκB-α的蛋白质印迹分析。(B) P65、p-P65、IκB-α与p-IκB-α蛋白的定量分析。(C) 小鼠脾细胞中P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK及p-JNK的蛋白质印迹检测。(D) P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK和p-JNK蛋白的定量分析。(E) RSAD2 mRNA表达水平。(F) 小鼠脾细胞中RSAD2的蛋白质印迹分析。(G) RSAD2蛋白的定量分析。不同组别中CD3+、CD4+或CD8+荧光强度(H–K)；CD3+相对荧光强度分析(L)，CD4+/CD8+相对荧光强度分析(M)。
Conclusion
本研究从金针菇中提取的多糖组分FVP-1在RAW264.7巨噬细胞和小鼠脾细胞中展现出免疫调节活性。结果可知，FVP-1是一种作用于脾脏等免疫器官和巨噬细胞的潜在免疫调节多糖，其通过RSAD2效应分子激活并调控NF-κB/MAPK信号通路来实现免疫调节功能。以上内容为全面解析生物活性多糖在机体内的免疫调节机制提供了新思路。
论文网址：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.142985