该成果以“The effect of Flammulina velutipes polysaccharide on immunization analyzed by intestinal flora and proteomics”为题发表在中科院TOP 1区期刊Frontiers in Nutrition（IF6.576）。
免疫抑制是免疫紊乱的一个明显特征，易引起肿瘤、感染、心血管疾病和糖尿病等疾病的发生，所以开发具有良好免疫调节作用的新药已成为急需解决的问题。近年来，食用菌及其多糖的免疫调节活性引起了的广泛关注。
金针菇（Flammulina velutipes）是担子菌亚门口蘑科金钱菌属真菌，是目前最受欢迎的食用菌之一，含有三萜、多糖、甾体和维生素等成分。文献调研发现，金针菇多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老、改善大鼠便秘等活性。金针菇多糖可调节健康小鼠肠道菌群，具有潜在的免疫调节能力。然而，这种具有生物活性的多糖对免疫缺陷小鼠免疫调节作用的靶蛋白仍有待研究。因此，本研究通过建立免疫抑制模型，探讨金针菇多糖在免疫低下小鼠体内的免疫调节机制，并通过体内蛋白质组学推断金针菇多糖的靶蛋白。
金针菇多糖的免疫调节作用
本实验以CTX进行造模，通过检测小鼠脏器指数、血清中乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活力以及细胞因子含量和抗氧化应激能力，发现金针菇多糖对免疫抑制小鼠具有免疫调节作用。
金针菇多糖可以提高小鼠胸腺指数和脾脏指数
Table 1. Effect of F. velutipes polysaccharide on the index of immune organs
Group |
Thymus index（mg/10*g） |
Spleen index（mg/10*g） |
BC |
10.96±4.66 |
26.77±2.14 |
MC |
5.54±1.31*** |
21.28±3.80* |
PC |
9.37±4.06## |
24.09±3.27 |
HD |
9.63±3.38## |
30.63±4.53### |
MD |
6.72±0.95 |
26.91±4.10# |
LD |
6.19±0.99 |
30.83±8.22### |
Compared with BC group: ***P < 0.001, *P < 0.05; Compared with MC group: ###P < 0.001, ##P < 0.01, #P < 0.05.
金针菇多糖可以增强小鼠ACP和LDH活力
Table 2. Effect of F. velutipes polysaccharide on serum ACP and LDH activity
Group |
ACP（unit/100 mL） |
LDH（U/L） |
BC |
7.75±1.26 |
5703.86±529.04 |
MC |
4.94±1.22*** |
4814.77±706.42* |
PC |
5.27±1.32 |
5736.72±431.79# |
HD |
6.79±2.00## |
6761.14±1148.8### |
MD |
5.39±0.80 |
6376.81±722.82### |
LD |
4.46±0.74 |
5989.80±1041.74## |
Compared with BC group: ***P < 0.001, *P < 0.05; Compared with MC group: ###P < 0.001, ##P < 0.01.
金针菇多糖能够改善小鼠血清中细胞因子含量
Figure 1. Effect of F. velutipes polysaccharide on serum cytokine content.
Compared with BC group: ***P < 0.001, **P < 0.01; Compared with MC group: ###P < 0.001, #P < 0.05.
金针菇多糖可以增强小鼠抗氧化应激能力
Figure 2. Effect of F. velutipes polysaccharide on antioxidant capacity of mice.
Compared with BC group: ***P < 0.001, **P < 0.01; Compared with MC group: ###P < 0.001, ##P < 0.01, #P < 0.05.
金针菇多糖对小鼠脾脏蛋白质组学研究
本实验取空白组、模型组、金针菇多糖高剂量组小鼠脾脏，进行蛋白质鉴定和IBT定量。将模型组与空白组相比，共有134个差异表达蛋白，其中上调的蛋白有52个，下调的蛋白有82；与模型组相比，给予金针菇多糖治疗后，共有46个差异表达蛋白，其中上调的蛋白有30个，下调的蛋白有16个。对鉴定到的蛋白质进行GO功能注释、差异蛋白Pathway富集分析、蛋白互作分析、亚细胞定位分析等。
Figure 3. Volcano plots of differentially expressed proteins in MC/BC (left) and HD/MC (right) (A), distribution of CV values of replicate experiments (B) and GO annotation histogram(C)
在显著富集的差异蛋白Pathway分析中发现与免疫相关的蛋白TFRC（Transferrin receptor protein 1）和RSAD2（Radical S-adenosyl methionine domain-containing protein 2）含量显著性增加。
Figure 4. Statistical plots of Pathway classification of differential proteins(A), statistical plots of significantly enriched pathway (B) and histogram of subcellular localization(C) in HD and MC groups
查阅文献发现促进TFRC的表达，增加细胞铁的摄取，有助于增强宿主抗肿瘤免疫的能力。在巨噬细胞中，RSAD2的细胞活性可能为细胞提供了一种保护机制，防止ROS水平的增加。通过Western blotting分析小鼠脾脏中TFRC和RSAD2蛋白表达，结果显示模型组的蛋白表达与空白组相比，极显著下调（P<0.001）；与模型组相比，高剂量组的蛋白表达极显著上调（P<0.001），这与蛋白质组学的结果一致。
Figure 5. Effect of F. velutipes polysaccharide on the expression levels of TFRC and RSAD2 proteins in mouse spleen
Compared with BC group: ***P < 0.001; Compared with MC group: ###P < 0.001.
金针菇多糖对小鼠肠道菌群的影响
通过对小鼠肠道微生物进行OTUs聚类分析，发现金针菇多糖给药组在门水平上中Firmicutes的相对丰度降低，Bacteroidetes的相对丰度升高。在属水平上Lachnospiraceae_NK4A136_group和f__Lachnospiraceae_Unclassified的相对丰度降低，而f__Muribaculaceae_Unclassified、Bacteroides、Alloprevotella相对丰度增加。
Figure 6. Relative abundance of dominant groups at phylum (A) and genus (B) level
在菌群alpha diversity分析和Beta Diversity分析中，与模型组比，给药组的菌群结构和菌群多样性也发生了改变。
Figure 7. Chao 1 index (A), Shannon index (B) based on alpha diversity analysis, PCA analysis performed on the distribution of strain communities (C)
金针菇多糖可以提高小鼠肠道中的SCFAs含量
Table 3. Effect of F. velutipes polysaccharide on the content of SCFAs
BC |
MC |
PC |
HD |
MD |
LD |
|
Acetic acid |
1.58±0.84 |
0.35±0.05* |
1.15±1.11 |
1.68±1.86# |
1.14±0.82 |
0.8±0.55 |
Propionic acid |
3.17±0.47 |
2.09±0.73 |
4.47±3.71# |
5.9±0.77### |
3.71±0.69 |
4.11±0.59# |
Butyric acid |
4.54±1.16 |
2.6±0.87* |
4.03±2.4 |
5.32±1.43## |
3.47±0.69 |
3.55±1.02 |
Compared with BC group: *P < 0.05; Compared with MC group: ###P < 0.001, ##P < 0.01, #P < 0.05.
综上所述，金针菇多糖可保护免疫抑制小鼠的免疫器官，改善小鼠血清细胞因子水平，增强机体抗氧化能力，促进肠道SCFAs含量的增加，调节蛋白TFRC和RSAD2的表达，促进能量代谢，增加菌群丰度，改善菌群结构，维持肠道内环境的稳态。研究结果表明，金针菇多糖具有潜在的免疫调节作用。
中心对金针菇进行了持续的研究,先后发表4篇论文：
1. The effect of Flammulina velutipes polysaccharide on immunization analyzed by intestinal flora and proteomics, Frontiers in Nutrition, 2022, https://doi.org/10.3389/fnut.2022.841230
2. Identification of Secondary Metabolites in Flammulina velutipes by UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS, Journal of Food Quality，2021, https://doi.org/10.1155/2021/4103952
3. Structural Identification and Coagulation Effect of Flammulina velutipes Polysaccharides, Appl. Sci. 2021, 11, 1736. https://doi.org/10.3390/app11041736
4. Effect of Flammulina velutipes (golden needle mushroom, eno-kitake) polysaccharides on constipation, Open Chemistry, 2018,16 (2):152–162, https://doi.org/10.1515/chem-2018-0017