在河南省重大公益专项：食用菌精深加工及保健食品创制关键技术及产业示范（201300110200）和精准营养与健康食品研究（CXJD2021006）项目资助下，河南大学国家食用菌中心康文艺教授团队与河北省食品检验研究院张岩研究员团队合作，对秀珍菇多糖结构进行鉴定，该成果以“A glucomannogalactan from Pleurotus geesteranus: Structural characterization, chain conformation and immunological effect” 为题发表于Carbohydrate Polymers杂志（即时IF：10.29）。
Introduction
秀珍菇（Pleurotus geesteranus）作为我国食用菌产业中发展最为迅速的品种之一，随着需求量的日益增加，对其功能和成分的研究也愈来愈多，多糖作为主要活性成分，目前已被发现具有抗肿瘤、降血脂、抗氧化和保肝等作用。尽管秀珍菇多糖具有巨大的药用潜力，但现有的结构数据不足以阐明其构象和进一步构效关系的研究，且免疫调节活性被公认为是食用菌多糖最重要的生物活性，但目前尚无对秀珍菇多糖免疫调节活性的研究。因此，本研究以秀珍菇为原料，采用水提醇沉法和柱色谱法分离纯化得到秀珍菇精制多糖，对其进行精细结构解析和分子链构象的表征，并评价其体外免疫调节活性。
Results and Discussion
化学成分和均一性分析
图1 PGP在DEAE-52柱上的洗脱曲线（A）；PGP-1和PGP-2在Sephadex G-100色谱柱上的洗脱曲线（B）；PGP及其纯化组分的HPGPC谱（C）；PGP-1c的HPGPC谱（D）；葡聚糖标准品的校准曲线（E）；PGP-1c的FT-IR光谱（F）
表1为PGP及其纯化部分的得率、中性糖含量、糖醛酸含量以及单糖组成。基于秀珍菇子实体干粉的重量，PGP产率为1.62%。PGP-1（水洗脱液）和PGP-2（0.05 M NaCl洗脱液）通过DEAE-52柱分馏后回收，得率分别为18.2%和16.5%（图1A）。通过Sephadex G-100柱进一步纯化PGp-1，通过苯酚-硫酸法（图1B）确定洗脱曲线中的三个峰（PGP-1a、PGP-1b和PGP-1c），而后使用HPGPC-ELSD法检测所有样品的分子量分布（图1C）。结果表明，PGP-1c的纯度和得率（12.0%）最高。此外，PGP-1c中的中性糖含量最高，糖醛酸含量最低（表1）。PMP-HPLC检测单糖组成发现， PGP、PGP-1a和PGP-1b含量最高的单糖是葡萄糖，PGP-1c由半乳糖（36.4%）、3-O-甲基半乳糖（未知峰，通过后续的甲基化分析m/z 130和190处的离子碎片确认）、甘露糖（20.7%）、葡萄糖（19.9%）和岩藻糖（2.2%）组成。
通过右旋糖酐标准曲线计算分子量（LogMw=−1.4874 RT+34.399，R2=0.9928），PGP-1c的分子量约为20.9 kDa（图1E）。根据分子量分布可以推断，PGP-1c是PGP的主要组成部分，其纯度、得率和中性糖含量最高，故选择PGP-1c作为后续的结构鉴定及生物活性评价。
PGP-1c的光谱分析
紫外光谱图中，PGP-1c在260和280 nm处没有吸收峰，进一步证明了PGP-1c中不含有游离的蛋白质和核酸。在图1F中，3368 cm-1处出现一个强吸收峰，代表O-H的伸缩振动，而C-H的伸缩振动对应于2929 cm-1处的一个弱峰。1644 cm-1左右的键可归因于-CHO的剪切振动。在约1066 cm-1处检测到一个强峰，对应于C-O的弯曲振动。此外，869 cm-1和916 cm-1处的吸收峰分别代表PGP-1c中的α和β构型的吸收峰。
PGP-1c的甲基化分析
表2. PGP-1c的甲基化分析结果
PGP-1c的甲基化分析结果见表2。在PGP-1c中发现了7个主要残基片段，其中Gal（46.5%）种类含量最高，残基片段包括→2,6)-Galp-(1→（26.1%）, →6)-Galp-(1→（17.4%）和→2)-Galp-(1→（2.9%），其次是Glc（24.8%）、Man（20.4%）和少量的Fuc（8.3%），结果与单糖组成相互验证。在→2,6)-Galp-(1→和→6)-Galp-(1→的质谱图中，发现在m/z 130和m/z 190处存在离子峰，表明了3-O-甲基半乳糖的存在。此外，PGP-1c支化度（DB）为48.6%，证明PGP-1c具有一定的分支，具体构象将从下面的NMR谱进一步解析。
PGP-1c的核磁波谱分析
图2 PGP-1c的1H NMR谱（A），13C NMR谱（B），1H/1H COSY（C和E），1H/13C HSQC（D和F）
在1H NMR（图2A）中，确定了PGP-1c异头质子的化学位移范围（4.50～5.39 ppm），其中化学位移为4.50、4.55和4.82 ppm的信号为β构型，其他为α构型，这与FT-IR的结论一致。此外，结合单糖组成，在高场区1.24和1.33 ppm的两个-CH3信号，证明PGP-1c中含有岩藻糖。根据1H NMR谱上3.45 ppm左右的重叠峰积分面积，结合13C NMR（图2B）、HSQC（图2D和2F）和甲基化分析结果，推断出3.47/59.1和3.45/58.9 ppm处的信号为O-甲基，验证了单糖组成和甲基化结果，证实O-甲基半乳糖的存在，分别是→2,6)-α-D-(3-O-Me)-Galp-(1→（片段d）及→6)-α-D-(3-O-Me)-Galp-(1→（片段f）。以同样方法归属其他片段的异头信号为5.39/102.21、5.18/103.29、5.15/101.39、5.03/100.95、5.03/100.95、4.52/105.59、4.55/105.75、4.50/105.83，初步判断为→3)-α-D-Glcp-(1→（片段a），→2,6)-α-D-Galp-(1→（片段b和c），→6)-α-D-Galp-(1→（片段e和e’），→3,6-β-D-Glcp-(1→（片段h），→4)-β-L-Fucp-(1→（片段i），→3)-β-L-Fucp-(1→（片段j）。由于信号重叠，无法确定PGP-1c中的所有单元和序列，如β-D-Manp-(1→的异头质子信号被D2O的溶剂峰所掩盖，根据甲基化结果，残基的相对比例和文献比对，依然可以推出β-D-Manp-(1→的存在。
为获取PGP-1c各主要片段的全部H和C的化学位移信息，以便确定各残基片段的连接顺序，进一步测定了2D NMR，通过谱图相关信号以及 1H和13C核之间的耦合，对各个残基上的化学位移进行归属。根据COSY（图2C），片段a的H-2、H-3、H-4、H-5和H-6的化学位移分别对应于3.71、3.95、3.69、4.03和3.90/3.76 ppm。根据HSQC（图2D），相应的13C NMR信号分别为73.4（C-2）、79.9（C-3）、75.7（C-4）、74.5（C-5）和63.81（C-6）ppm。因此，进一步确定了片段a为→3)-α-D-Glcp-(1→，这与单糖组成和甲基化相互验证，并与文献中的化学位移一致。
从甲基化分析结果可知，在PGP-1c中→2,6)-Galp-(1→的含量为26.14%，在所有残基中所占比例最大，对照氢谱积分结果，识别出→2,6)-Galp-(1→异头氢所对应的化学位移为5.15 ppm，通过COSY，先后归属H-2、H-3、H-4、H-5、H-6的化学位移为3.98、4.05、4.07、4.23和3.95/3.73 ppm，后根据HSQC推导出相应13C的信号，其C-2、C-3、C-4、C-5、C-6的化学位移依次对应于77.9、72.4、72.5、71.7和71.5 ppm，同时上述化学位移值与相关文献的参考值一致。其他片段的H-2/C-2～H-6/C-6的化学位移以上述方法推导和分配，表3中列出了所归属的详细化学位移。
在确定了相应化学位移的残基片段后，通过HMBC进一步分析和确定PGP-1c中不同残基之间的连接性和分子骨架的结构信息。片段g的H-1和片段d/f的C-6、片段a/h/j的C-3、片段b/c的C-2、片段i的C-4相耦合，片段g的C-1和片段d的H-2发生耦合，表明β-D-Manp-(1→和以上残基片段均可能发生相互连接。结合糖残基的比例，初步推断PGP-1c是由→6)-α-D-Galp-(1→作为主链，48.6%支化度的支链主要为β-D-Manp-(1→。同理，片段b的H-1与片段d的C-6、片段d的H-1与片段c的C-6、片段c的H-1与片段d的C-6、片段d的H-1与片段e的C-6、片段e的H-1与片段c的C-6、片段c的H-1与片段e的C-6、片段e的H-1与片段d的C-6、片段d和c的H-1之间也存在相关性。在HMBC谱中观察到的PGP-1c中相邻残基上C和H的关联信息总结在表3中。
由于共振跃迁产生的磁场，片段a的信号非常微弱，难以与HMBC中的其他片段生成连接位点，根据分支程度、单糖组成和残基片段的比例，推测→3)-α-Glcp-(1)→连接在→2,6)-α-Galp-(1→和→2,6)-α-(3-O-Me)-Galp-(1→的O-2位。基于以上结果，通过比较PGP-1c酸水解前后的甲基化分析结果，得到了PGP-1c的预测结构模型（图3），具体的构象和支链信息还需通过链构象进一步探究和证实。
图3 PGP-1c的预测结构模型
PGP-1c的分子链构象
在图4中，PGP-1c的3D结构呈不同大小的山峦（或岛屿）状（高度10～100 nm，平均高度24.5 nm，宽度100～800 nm，长度300～1500 nm），峰高可以看作是多糖分子链长度的反映，表示支链的长度，峰宽反映了这些分子的分子间聚集行为。在侧耳属多糖的链构象中，岛屿状结构并不少见，但单链高度一般为0.1～1 nm，PGP-1c与同属中多糖相比具有少见的长支链结构。因此，PGP-1c具有长支链和堆叠的多链结构，以及一定的分子聚集性，进一步验证了第二章推测的结构模型，也表明它可能具有三螺旋结构。
在图5A中，PGP-1c的XRD光谱在14.72、17.44、30.07、31.03和42.03（2θ）处显示出5个不同的尖峰和窄峰，但整体呈圆形宽峰，这表明PGP-1c结构中同时存在无定形和结晶区域，即半结晶结构。如图5B所示，刚果红溶液中PGP-1c的存在导致最大吸收波长出现明显的红移，表明PGP-1c-刚果红复合物已经形成。随后的结果表明PGP-1c-刚果红复合物在低NaOH浓度下具有三螺旋结构。随着NaOH浓度的增加，PGP-1c-刚果红复合物最大吸收波长的减少幅度大于刚果红，三螺旋构象转变为单螺旋构象，验证了原子力显微镜的结论。
在图5C中， PGP-1c在水溶液中的平均粒度分布在205 nm左右，呈现窄对称的信号，表明了秀珍菇多糖的高纯度，与HPGPC结果相互验证。图5D中为在1000和5000放大倍数下的PGP-1c表观结构，PGP-1c呈现为丰富的纤维丝状伴有少量带状物由圆形结点连接无序交织在一起，形成松散排列的网络结构，与AFM形态分析结果一致，进一步证实了PGP-1c中的缠结和分支结构。
图4 PGP-1c的原子力显微镜图（A、B、C：20 μm；D、E、F：5 μm）
图5 PGP-1c的XRD图谱（A）；三螺旋结构分析（B）；动态光散射的尺寸分布（C）；在100μm和20μm的标尺上扫描电镜图像（D）
PGP-1c对巨噬细胞活力的影响
为探究PGP-1c对巨噬细胞RAW 264.7活力的影响，采用MTT法评估PGP-1c在12.5～800 μg/mL剂量范围内的作用。结果（图6A）显示PGP-1c在12.5～400 μg/mL范围内对RAW 264.7细胞没有毒性作用，选择100、200和400 μg/mL的浓度进行下一步实验。
图6 PGP-1c对RAW264.7细胞活力的影响（A）。PGP-1c 对 RAW264.7 细胞中 NO（B）、IL-6（C）和 TNF-α（D） 产生的影响。数据以平均值±标准差表示，n = 3。与对照组相比，***P < 0.001，**P < 0.01，*P<0.05
PGP-1c的免疫调节活性
图6B中，与空白组相比，PGP-1c在浓度为100～400 μg/mL范围内可显著刺激RAW 264.7细胞分泌NO，并呈现明显的量效关系。100 μg/mL的PGP-1c作用于细胞24 h后，NO分泌量达到12.03 ± 0.13 μM，比空白组增加了3.08 μM，是LPS阳性对照组的54.45%，NO含量的增加表明PGP-1c可能具有良好的免疫促进作用和抑制肿瘤细胞生长的活性。图6C中，与空白对照组相比，不同浓度（200～400 μg/mL）的PGP-1c可显著促进RAW 264.7细胞分泌IL-6（P<0.01），并呈现明显的剂量依赖性。在图6D中，PGP-1c（100～400 μg/mL）显著促进了RAW 264.7细胞中TNF-α的释放，其中100和200 μg/mL的PGP-1c活性为极显著（P<0.001）。PGP-1c促进RAW 264.7细胞释放细胞因子的结果表明PGP-1c具有良好的免疫增强能力。
Conclusion
从秀珍菇中得到了一种分子量为20.9 kDa的精制多糖PGP-1c，是由无取代位（1,6-α-Gal和1,6-α-3-OMe-Gal）和单取代位（1,2,6-α-Gal和1,2,6-α-3-OMe-Gal）的半乳糖单元通过α-(1→6)连接的主链和β-D-Manp-(1→、→3)-α-D-Glcp-(1→和少量的Fucp作为侧链组成的支化度为48%的葡甘露半乳聚糖。此外，链构象表征发现PGP-1c具有长支链和堆叠的多链网络结构，以及具有抗肿瘤免疫活性特征的三螺旋结构。通过检测PGP-1c对巨噬细胞NO和细胞因子分泌能力的影响，发现具有3-O-CH3基团、三螺旋和多支链结构的秀珍菇多糖具有良好的免疫调节活性。
通讯作者简介
康文艺，博士，二级教授，河南大学国家食用菌加工技术研发专业中心主任、河南省功能食品工程技术研究中心主任、河南省药食两用资源功能研究国际联合实验室主任、河南省食用菌精深加工产业技术创新战略联盟理事长、全国专业标准化技术委员会委员、中国菌物学会食用菌采后与加工产业分会副会长、中国营养学会营养与保健食品分会常务委员、世界中联中药上市后再评价专业委员会常务理事、国家食品药品监督管理总局特殊食品抽检监测牵头分析专家委员、河南省中药学博士后创新团队副主任、河南省工业技改专家等。目前主要研究方向为药食两用资源的物质基础、其中关键生物活性分子的药效评价及其作用机制，以及原料及其衍生产品的检测方法和质量管理。目前主持“十三五”国家重点研发计划子课题1项，食药总局保健食品专项2项，河南省重大公益专项1项以及省部级项目10余项；发表研究论文400余篇，其中SCI高水平论文超过100篇。基于此工作基础，在2020年获得河南省科技进步奖二等奖和中国商业联合会特等奖。
通讯作者简介
张岩，男，研究员，医学博士后，河北省食品检验研究院副院长，享受国务院特殊津贴专家，河北省“三三三”人才工程第一层次人选，河北省青年拔尖人才，国际标准化组织生物技术委员会生物分析方法工作组专家，第二届食品安全国家标准审评委员会委员，《Food Science and Human Wellness》副主编（SCI收录），《Journal of Food Quality》副主编（SCI收录），国家市场监管总局北京冬奥会食品供应安全工作协调小组专家组成员，北京市2022年冬奥食品安全保障专家委员会委员。近年来，该同志承担“十三五”、“十二五”等国家级科研项目和省部级科研项目30余项，发表高水平学术论文200余篇，参编出版专著24部，授权国家发明专利9项，登记计算机软件著作权8项；制修订国家标准54项、行业标准11项、地方标准65项，科研成果获得省部级科技进步奖25项。
第一作者简介
梁振华，河南大学2019级硕士研究生，主要研究方向是多糖的结构与生物活性。在读期间获得国家奖学金和河南省三好学生称号，以第一作者及共同第一作者在Carbohydrate Polymers、Food Science and Human Wellness等杂志发表SCI论文6篇。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2022.119346