该成果以"Efficient Breeding and Metabolomic Characterization ofBacillus safensis Mutants with High-Antagonistic Activity Based on Droplet Microfluidics Technology"发表于中科院1区Top《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（IF 6.2）。贵州大学魏龙凤博士和潘航博士为共同第一作者，贵州大学李祝教授与清华大学张翀教授为共同通讯作者。
01 Introduction
由胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwinia carotovora subsp. carotovora, Ecc）等病原菌引起的软腐病是全球蔬菜及观赏植物上最具毁灭性的细菌病害之一，导致严重的经济损失。化学防治面临环境污染和病原菌抗药性等问题，而生物防治虽具可持续性，但天然拮抗菌株的抑菌活性往往有限，难以满足实际应用需求。常压室温等离子体（ARTP）是一种创新且高效的微生物育种方法，已被广泛用于细菌、真菌等微生物的改良，以获得高性能菌株；ARTP诱变能高效构建含百万级突变体的突变文库，但传统的琼脂平板或微孔板筛选方法通量低、耗力耗时，成为菌株改良的瓶颈。近年来，液滴微流控特别是荧光激活液滴分选（FADS）技术通过单细胞包裹和超高通量分析（>10⁶个细胞/次），为功能菌株筛选提供了全新工具，然而直接针对植物病原菌拮抗表型的高通量筛选仍鲜有报道。
本研究建立了整合ARTP诱变与FADS的高通量筛选平台，以GFP标记的Erwinia carotovora Ecc15为报告菌株，通过液滴内低荧光信号直接筛选高拮抗活性Bacillus safensis突变株，并利用代谢组学表征其生防潜力，明确关键抗菌代谢物。本研究试图解决生防菌株诱变后筛选效率低、活性提升机制不清晰的科学问题，同时首次探索微生物来源克林霉素的生物合成及其与喹啉酸的协同抑菌作用，为高效生防菌株选育及新型生物农药开发提供可行策略与理论依据。
02 Results
该研究将ARTP诱变、液滴微流控高通量筛选技术整合，成功获得一株对多种植物病原菌具有广谱拮抗活性的B. safensis突变株R1，并进一步通过代谢组表征拮抗活性提升的原因，揭示突变株R1中关键的差异表达抗菌代谢物喹啉酸与克林霉素的协同抗菌机制。该研究不仅为生防菌株选育提供全新策略，也为农作物细菌性病害的绿色防控提供高效候选资源。
1、高效突变文库构建与液滴微流控筛选
本研究建立了ARTP诱变耦合液滴微流控FADS高通量筛选体系，实现对B. safensis突变体库的高效分选（图1）。首先通过ARTP诱变30 s获得致死率达85.11%的突变体库，确保突变多样性；随后将突变株单细胞包裹于14 pL油包水液滴中，遵循泊松分布实现单细胞封装，经4 h培养后利用注入芯片注入GFP标记的报告菌株E. carotovora Ecc15（GFP-Ecc15），共培养24 h后以液滴中荧光信号为指示进行分选。此时，若液滴内的B. safensis突变株具有较强拮抗活性，则会抑制报告菌生长，导致液滴荧光强度显著降低。系统以150 Hz频率分选荧光强度最低的前0.1%液滴，3 h内完成约10⁶个液滴分选，较传统平板筛选效率提升1000倍以上。经破乳、涂布培养，共挑选113个单菌落用于后续验证，为后续高通量复筛提供高活性材料，成功解决传统诱变育种筛选通量低、周期长的技术瓶颈。
图1基于FADS平台高通量筛选B. safensis菌株的技术流程图
图2 基于FADS技术对B. safensis突变体库进行筛选
2、高拮抗活性突变株的筛选与抗菌活性表征
对分选获得的突变株进行抑菌活性表征，筛选出广谱高拮抗突变株R1。以软腐病菌 Ecc15为指示菌进行抑菌圈测定，32株突变株抑菌活性显著提升，其中R1抑菌圈直径达 26.15 mm，较出发菌株D-62 提高42.82%。广谱抑菌试验显示，R1对多种农业重大病原菌表现强效抑制能力，对青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌的抑菌圈分别扩大129.16%与95.59%；对4种病原真菌抑菌率均超84%，其中对黑孢霉菌抑菌率高达97.96%，且对多数病原细菌与真菌均具有显著抑制活性。上述结果表明，R1突破野生型菌株抑菌谱窄、活性偏低的局限，兼具抗细菌与抗真菌能力，是一株具备产业化潜力的广谱生防菌株。这些数据表明FADS平台能够高效分离出拮抗活性显著增强的突变株，为植物病害绿色防控提供高效候选资源。
图3 B. safensis突变株的抗菌活性
3、比较代谢组学挖掘差异表达抗菌代谢物
为阐明R1抗菌活性增强的原因，对出发菌D-62、高活性突变株R1和低活性突变株R112进行了非靶向代谢组学分析。PCA和PLS-DA显示三株菌的代谢谱明显分离，模型稳定无过拟合。共鉴定出1158种差异代谢物，其中R1 vs D-62组有857个差异代谢物，主要涉及脂质和有机酸类。KEGG通路富集分析显示，R1 vs D-62组中辅因子生物合成途径的差异代谢物最多；多种已知抗菌代谢物如喹啉酸、烟酰胺等在R1中显著上调。进一步比较R1 vs D-62组与R112 vs D-62组的差异代谢物，发现R1 vs D-62组特有18种具有明确抗真菌、抗细菌或促植物生长活性的生物活性代谢物，包括克林霉素、克林霉素磷酸酯、壬二酸、核黄素等；而R112 vs D-62组中多数抗菌代谢物下调，并检测到多种植物毒性物质（如黄绿青霉素、马钱子碱氧化物等）。上述结果表明，R1优异的抗菌性能在机制上归因于ARTP 诱变后其特异性抗菌代谢物含量的增加。代谢组结果明确R1抗菌能力提升源于抗菌代谢物的全局重塑，为后续机制验证提供精准靶点。
图4 代谢组学分析及差异表达代谢物（DEMs）变化
4、喹啉酸与克林霉素的抗菌活性及协同效应
体外抑菌试验显示，0.5 mg/mL喹啉酸和克林霉素对病原菌Ecc15的抑制率分别为94.77%和92.56%，EC₅₀分别为0.1493 mg/mL和0.0445 mg/mL。对八种病原微生物的抑菌广谱性结果显示，喹啉酸对真菌（黑孢霉菌、齐整小核菌、禾谷镰刀菌）的EC₅₀低至0.11 mg/mL，克林霉素则对细菌（根癌农杆菌、青枯雷尔氏菌等）更有效。HPLC定量证实，R1中喹啉酸含量（38.48 μg/mL）较D‑62提高46%，克林霉素含量（9.08 μg/mL）首次在微生物发酵中被检测到。相关性分析显示喹啉酸与克林霉素之间存在高度正相关（r = 0.86）。协同效应（SR）计算表明，喹啉酸:克林霉素=1:9、2:8、3:7时呈现协同作用（SR > 1.5），其中1:9效果最显著（SR = 2.45）。在白菜软腐病活体防效中，三种协同组合对白菜软腐病的保护效果均超过75%，显著优于单剂；治疗效果也以1:9组合最佳（67.57%）。综上，喹啉酸与克林霉素的协同作用显著增强了R1的广谱抗菌能力，为开发高效、低剂量生防制剂提供了新策略。
图5 目标代谢物的体外抗菌活性
图6 喹啉酸-克林霉素复配溶液的抗菌活性
03 Conclusion
该研究将ARTP诱变、液滴微流控高通量筛选技术整合，成功获得一株对多种植物病原菌具有广谱拮抗活性的B. safensis突变株R1，并进一步通过代谢组表征拮抗活性提升的原因，揭示突变株R1中关键的差异表达抗菌代谢物喹啉酸与克林霉素的协同抗菌机制。该研究不仅为生防菌株选育提供全新策略，也为农作物细菌性病害的绿色防控提供高效候选资源。
作者简介：
第一作者（魏龙凤）
魏龙凤，女，贵州大学生命科学学院2023级博士研究生，主要研究方向为植物病害生防菌高通量选育，高效活性代谢物生物合成途径改造，生防菌及抗菌代谢物对病原微生物的作用机理研究等。目前参与科研项目2项，发表SCI论文5篇。
第一作者（潘航）
潘航，男，贵州大学生命科学学院2025级博士研究生，主要研究方向为植物病害的生物防治、田间防控，抗菌代谢产物生物合成途径挖掘及其拮抗植物病原菌的作用机制等研究。目前目前参与科研项目1项，发表SCI论文3篇。
通讯作者（李祝教授）
李祝，女，贵州大学生命科学学院三级教授，博士生导师，省管专家，贵州省高层次创新型人才“百层次”，贵州省优秀青年科技人才。主要从事微生物学领域的研究工作，主要包括植物病原菌的分离鉴定、液滴微流控超高通量筛选生防细菌、微生物活性代谢物的生物合成途径或代谢通路的拼接与改造、微生物育种等研究内容。主持国家级、省部级项目15项，在Journal of Agricultural and Food Chemistry，Food Science and Human Wellness，Pest management science，Plant disease，食品科学，农药等中英文期刊发表论文100余篇，授权中国发明专利18项，授权国际发明专利2项。获2019-2021年度全国农牧渔业丰收奖三等奖，2021-2022年度贵州省专利奖“银奖”，贵州省科学技术进步二等奖，第十二届“大北农科技创新奖”等奖项。
通讯作者（张翀教授）
张翀，男，清华大学化学工程系长聘教授，重组蛋白合成生物制造北京市重点实验室常务副主任，绿色生物制造全国重点实验室、工业生物催化教育部重点实验室、清华大学系统与合成生物学研究中心PI。研究方向为生物化工、合成生物学与绿色生物制造，在Nature Chemical Biology，Nature Communications，Science Advances等刊物发表论文100余篇，申请中国发明专利20余项，牵头制定国家标准5项。担任全国发酵工程技术工作委员会委员，全国生物过程标准化工作组（SWG36）委员，中国生物发酵产业协会微生物育种工程与应用评价分会秘书长，中国生物信息学会（筹）计算合成生物学分会常务委员，中国微生物学会工业微生物专委会、中国医药生物技术协会合成生物技术分会、中国生化制药工业协会重组药物分会委员，Journal of Bioscience Bioengineering副主编，BMC Biotechnology、Engineering Biology、合成生物学等期刊编委。曾荣获教育部青年长江学者、亚洲青年生物工程奖（日本生物工学会）、日内瓦国际发明博览会金奖、伦世仪发酵工程杰出青年学者奖、中国轻工业联合会技术发明一等奖、科技进步二等奖等荣誉和奖励。
