该成果以“Bakuchiol ameliorates glycolipid homeostasis by reducing inflammation” 为题发表在中科院TOP 1区期刊Food Science and Human Wellness杂志（IF5.6）
Introduction
糖尿病（DM）是一种因胰岛素绝对或相对分泌不足和（或）胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢紊乱性疾病，以血浆葡萄糖升高为主要标志。2型糖尿病（T2DM）是由于靶器官对胰岛素的敏感性降低，胰岛β细胞分泌胰岛素障碍引起的，其发病机制是胰岛素抵抗（IR）。IR的发展常伴有慢性炎症。炎症因子可干扰胰岛素信号通路，加重IR。炎症导致的IR主要依赖于IRS1/ PI3K/ Akt信号通路中的IRS1。炎症因子的分泌可激活MAPK信号通路，促使JNK激活IRS1的丝氨酸和苏氨酸残基，抑制IRS1正常酪氨酸位点的磷酸化，进而抑制PI3K/Akt信号通路，抑制脂肪细胞中GLUT4的转运，导致外周组织胰岛素利用减少，最终导致IR。因此，IRS1磷酸化在炎症诱导的胰岛素信号和IR受损中起关键作用。
天然产物，特别是萜类化合物，因其作用有效、过程温和、毒副作用低，已被报道具有良好的降糖作用，在治疗T2DM及其并发症中发挥重要作用。补骨脂为豆科植物补骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥果实，具有温肾助阳的功效，外用消风祛斑，同时具有抗肿瘤、抗菌、抗炎和降血压等生物活性。从补骨脂中分离得到的补骨脂酚（BL）可改善糖尿病小鼠的血糖水平，减轻高血糖引起的糖尿病性心肌病。然而，BL是否具有改善高脂饮食引起的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗的能力尚不清楚。为阐明这一点，作者利用多组学技术以及脂肪细胞和巨噬细胞两种细胞系，发现BL通过抑制TLR4/ NF-κB和MAPK信号通路，从而激活SOCS3 /IRS1介导的胰岛素信号传导抑制。本研究首次揭示了BL有效改善炎症诱导的胰岛素抵抗和炎症引起的糖脂代谢紊乱的机制。
图1 BL通过抗炎改善糖脂稳态的机制图
Results and Discussion
BL改善T2DM小鼠的糖脂稳态和炎症因子水平
为确定补骨脂酚（BL结构式如图2A）的降糖作用，作者首先评估了BL对T2DM小鼠血糖参数和胰岛素水平的影响。结果发现，BL可显著降低小鼠空腹血糖（FBG）、糖化血清蛋白（GSP）水平（图2B、C），且效果优于阳性对照药物二甲双胍，同时发现其可显著升高小鼠的胰岛素水平（图2D）。为阐明BL降血糖的作用机制，作者进行了IBT定量蛋白质组学分析。
根据GO富集分析中富集因子的大小排序，发现BL治疗组的抗炎功能最显著。此外，肠道调节（胰液分泌、肠道胆固醇吸收）、脂质代谢（甘油三酯、血浆脂蛋白和胆固醇）和抗氧化（氧化还原酶活性和类视黄醇代谢）功能也发生改变（图2E）。为进一步确认蛋白质组学结果，作者对上述生物过程进行了逐步验证。
首先是对细胞因子分泌的验证。ELISA法检测小鼠血清中IL-6、TNF-α水平，发现BL可显著降低STZ诱导的炎症因子升高。随后，使用16S rRNA测序和HPLC检测短链脂肪酸含量，验证了BL对肠道的调节功能。结果显示，BL降低了Lachnospiraceae的丰度，增加了Roseburia的丰度。Lachnospiraceae是肠道的核心菌，主要通过产生乙酸为宿主提供能量；而Roseburia是一种抗炎因子，可以产生大量的丁酸与宿主相互作用。脂肪酸含量结果表明，经过BL处理后，乙酸丰度显著降低，丁酸丰度显著升高。这与菌群测序结果一致，进一步证明了BL可通过肠道微生物及其代谢物与宿主相互作用，发挥抗炎功能。
进一步，作者验证了BL的脂质代谢功能。结果表明，BL可有效降低血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平（图2G和H），同时可升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平（图2H）。通过H&E染色观察到BL改善了糖尿病小鼠肝脏和胰腺组织的损伤（图2I和2J）。此外，显著降低MDA水平和显著增加CAT， SOD和T-AOC水平（图2K），BL可以有效地减弱组织过氧化损伤，验证了蛋白质组学功能的预测结果。
上述证据表明，包括肠道菌群、IR的病理基础以及氧化应激诱导的炎症，都表明BL可能主要通过抗炎发挥其降糖功能，下一步作者将研究BL如何通过抗炎调节葡萄糖稳态。
图2 BL对T2DM小鼠的降糖作用。（A） BL的化学结构。（B） BL对小鼠空腹血糖的影响。（C） BL对小鼠GSP的影响。（D） BL对小鼠血清胰岛素水平的影响。（E）根据富集因子排序获得到的前10个GO条目。（F） BL对小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6水平的影响。（G） BL对小鼠血清TG和TC水平的影响。（H） BL对小鼠血清HDL-C和LDL-C水平的影响。（1） BL对小鼠胰腺组织的病理作用。（J） BL对小鼠肝组织病理效应的影响。（K） BL对小鼠MDA和T-AOC的影响。
BL可改善3T3-L1脂肪细胞的IR
胰岛素受体信号通路阻断是糖尿病人发病的主要机制，并常伴有炎症。因此，为了证实BL对IR和降糖活性的影响，作者首先研究了BL在3T3-L1脂肪细胞中的作用。MTT实验表明BL在3.25至50 µmol/L的浓度范围内，无细胞毒性（图3A）。在脂肪细胞诱导分化成熟后，发现BL显著促进脂肪细胞的葡萄糖摄取能力（图3B），显著促进GLUT4转录（图3C）和蛋白表达水平（图3D），其作用与阳性对照正钒酸钠（Van）相当。为阐明BL在脂肪细胞中的降血糖途径，作者发现BL激活了胰岛素通路的中心环节IRS1/PI3K/Akt轴，并且PI3K的催化亚基p110α被BL显著提高，IRS1和Akt的表达和磷酸化水平也同样升高（图3E和F）。之后，使用特异性通路抑制剂Wortmannin （Wort），检测p110α和Akt的表达水平（图3G和H）。结果证实BL可通过激活PI3K/ Akt信号通路改善3T3-L1脂肪细胞的IR。
图3 BL通过IRS1/PI-3K/Akt信号通路改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗。（A）BL对细胞活力的影响。（B） BL对上层清液中葡萄糖含量的影响。（C, D） qPCR和WB检测BL对GLUT4的影响。（E, F）BL对IRS1 / PI3K / Akt相关蛋白表达。（G, H）使用通路抑制剂后，检测BL对PI3K / Akt信号通路相关蛋白表达的作用
BL抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症和氧化应激
通过LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型来证实BL的抗炎作用。MTT检测发现，在3.125 ~ 50 µmol/L浓度范围内，BL对细胞活力没有影响（图4A），故选择12.5 ~ 50 µmol/L作为给药浓度。BL显著抑制NO分泌能力（图4B）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）转录水平（图4C）和蛋白表达（图4D），这是TLR配体和炎症细胞因子诱导M1巨噬细胞的特征分子。BL还显著抑制环氧化酶2 （COX-2）的转录（图4E）和蛋白表达水平（图4F），COX-2是炎症反应中常见的诱导酶。此外，BL同样降低了促炎细胞因子如IL-6（图4G）和TNF-α（图4H）的水平。
接下来，作者试图阐明BL减轻LPS诱导炎症的机制。在糖尿病小鼠的蛋白质组测序结果中，GO分析也显示了与MAPK通路激活相关功能的富集。此外，BL处理显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平（图5A）。此外，TNF-α水平升高提示NF-κB可通过复合物p65组分的核易位引起炎症基因的激活，而TLR作为先天免疫系统的组成部分，可识别微生物组分的分子模式，TLR4/NF-κB信号通路可导致机体炎症。因此，作者研究了BL对TLR4/NF-κB信号通路的抗炎作用。结果表明，BL有效抑制了RAW264.7细胞中TLR4、MyD88、TICAM1的转录水平（图5B），以及NF-κB磷酸化和NF-κB （IκB）表达（图5C）。此外，通过激光共聚焦观察到，BL显著抑制NF-κB的核易位（图5D）。此外，流式细胞术分析显示，BL显著降低了RAW264.7细胞中LPS诱导的ROS含量（图5E）。这些实验结果表明，BL对LPS诱导的炎症和氧化应激具有抑制作用。
图4 BL对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的影响。（A） BL对RAW264.7细胞活力的影响。（B） BL对RAW264.7细胞NO分泌的影响。（C） qPCR检测BL对RAW264.7细胞iNOS表达的影响。（D） Western blot检测BL对RAW264.7细胞iNOS蛋白表达的影响。（E） qPCR检测BL对RAW264.7细胞COX-2转录的影响。（F） Western blot检测COX-2蛋白在RAW264.7细胞中的表达水平。（G） BL对RAW264.7细胞IL-6分泌及其mRNA转录的影响。（H） BL对RAW264.7细胞TNF-α分泌及其mRNA转录的影响。
图5 BL通过TLR4/NF-κB和MAPK信号通路抑制RAW264.7细胞的炎症。（A）通过Western bloc分析BL对MAPK信号通路相关蛋白表达的影响，并通过Image j定量分析。（B） qPCR分析RAW264.7细胞中TLR4、MyD88和TICAM1的表达水平。（C） Western blot分析BL对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响，Image j定量分析。（D）激光共聚焦显微镜观察BL对p65核易位的影响。（E）流式细胞术检测BL对lps诱导RAW264.7细胞中ROS含量的影响，并通过相对荧光强度分析定量。
BL通过抗炎改善3T3-L1脂肪细胞的IR
进一步，作者旨在阐明炎症与IR之间的因果关系。首先通过倒置荧光显微镜观察Transwell小室，研究RAW264.7细胞向脂肪细胞的迁移过程（图6A）。结果发现，BL抑制了RAW264.7细胞向脂肪细胞的浸润（图6B）。同样，BL降低了脂肪细胞中TNF-α刺激引起的炎症因子和趋化因子的升高（图6C）。SOCS3作为泛素化的连接蛋白，可以竞争性地抑制IRS1的磷酸化，从而导致IR。因此，Western blot分析显示，BL显著降低了SOCS3的表达，提高了IRS1的磷酸化水平。这些发现表明，BL可有效改善3T3-L1脂肪细胞炎症诱导的IR（图6D）。此外，BL降低了TNF-α刺激升高的NF-κB磷酸化和IκB表达水平（图6E），同样降低了JNK的磷酸化水平，进一步证实了BL具有良好的抗炎和降糖作用。
图6 BL通过抗炎缓解3T3-L1脂肪细胞IR。（A） BL对RAW264.7细胞向3T3-L1脂肪细胞迁移的影响。（B）相对迁移率分析定量图。（C）用qPCR分析3T3-L1脂肪细胞中炎症相关基因的mRNA表达。（D） Western blot检测BL对3T3-L1脂肪细胞中SOCS3/IRS1信号通路相关蛋白表达的影响。（E） Western blot分析BL对3T3-L1脂肪细胞中NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。
Conclusion
本研究探讨了BL降低胰岛素抵抗和改善糖脂代谢的具体机制。结果发现BL通过抑制TLR4/NF-κB和MAPK信号通路减轻炎症，进一步影响JNK/SOCS3/IRS1通路改善胰岛素抵抗。以上内容为BL相关降糖药物的开发提供了基础。
论文网址:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213453024002684