败酱属植物斑花败酱是一种具有较高营养和药用价值的中药材。文章对其化学成分持续研究并分离出6种新的环烯醚萜类化合物——patriscabioins P–U (1-6)，通过核磁共振(1D & 2D)、质谱、红外光谱和紫外光谱等方法进行了结构解析确定，并评估了化合物5在IR-HepG-2细胞模型上的胰岛素抵抗活性。结果与对照组相比，化合物5没有细胞毒性，且能促进IR-HepG-2细胞的葡萄糖摄取。通过进一步的机制研究发现，新化合物5能增加PI-3 K、p-AKT、GLUT4和p-GSK3β蛋白的表达水平，同时抑制PEPCK和G6Pase两种关键的糖异生酶的表达。因此，化合物5可以通过激活PI-3 K/AKT信号通路促进GLUT4向细胞膜的转运，同时促进糖原合成并抑制糖异生的发生，从而达到改善胰岛素抵抗的作用。
该成果以“Effects of undescribed iridoids in Patrinia punctiflora on insulin resistance in HepG2 cells”为题发表于中科院三区期刊Fitoterapia杂志 (IF 2.5)。
Introduction
2型糖尿病(T2DM)的患病率已达到流行病的程度，据估计全世界有超过4亿人受其影响。长期高血糖会导致许多并发症，如心脏病、肾病、神经损伤等，严重威胁生命和健康。以往对药食两用资源败酱属植物的化学研究表明，这些植物富含环烯醚萜类化合物，如斑花败酱、黄花白酱、白花败酱。环烯醚萜类化合物是一类特殊的单萜类化合物，具有广泛的生物活性，包括抗病毒、抗炎、抗菌、保肝、抗氧化、神经保护作用等。从败酱属植物中分离的环烯醚萜可以激活PI-3 K/AKT通路，抑制NF-κB通路和MAPK通路，改善氧化应激，在改善IR方面表现出多通路作用，环烯醚萜在降糖方面显示出巨大的潜力。
对三种败酱属植物降糖活性筛选结果显示，斑花败酱75％乙醇提取物在12.5 ~ 200 μg/mL浓度下具有显著的降糖活性。为此，我们对斑花败酱中的化合物进行分离、结构表征，并对降糖活性及其作用机制进行了研究。共分离出了6个新化合物，均为环烯醚萜类化合物。
Results and Discussion
1.结构解析
通过核磁共振(1D & 2D)、质谱、红外光谱和紫外光谱等方法对它们的结构进行了结构解析敲定。
Figure 1. Undescribed iridoids in Patrinia punctiflora.
2.化合物5对HepG-2细胞活力的影响
观察化合物5对IR-HepG-2细胞降血糖活性的影响。采用MTT法检测化合物5在12.5 ~ 200 μmol/L浓度范围内对HepG-2细胞的活性。与对照组相比，化合物5在12.5、25、50、100和200 μmol/L浓度下对HepG-2细胞无显著影响。然后选择12.5、25和50 μmol/L的浓度进行进一步研究。
Figure 2. Effects of compound 5 on HepG-2 cell viability
3. 化合物5对IR-HepG-2细胞葡萄糖摄取的影响
对三采用GOD-POD法测定上清液中的葡萄糖含量，然后计算葡萄糖摄入量。在用8 mmol /L GlcN诱导HepG-2细胞后，模型组的葡萄糖摄取明显低于对照组，说明GlcN成功建立IR模型。ROSI组的葡萄糖摄取明显高于模型组，说明ROSI能够促进IR-HepG-2细胞的葡萄糖摄取。化合物5处理48 h后，IR-HepG-2细胞的葡萄糖摄取在所有浓度下均显著增加。结果表明，化合物5可以通过增加IR- HepG -2细胞的葡萄糖摄取来改善IR。
Figure 3. Effects of compound 5 on glucose uptake in IR-HepG-2 cells. Compared with the control group, ###P< 0.001. Compared with model group, **P < 0.01,***P<0.001
4.相关mRNA的表达
采用实时荧光定量PCR检测化合物5对PI-3K/AKT信号通路相关mRNA转录的影响。图5显示，与对照组相比，GlcN显著抑制了PI-3K、AKT和GSK3β mRNA的转录，而PEPCK和G6Pase mRNA的表达明显升高。不同浓度化合物4处理后，PI-3K、AKT、GSK3β mRNA表达均显著上调。PEPCK和G6Pase的mRNA表达显著下调。
Figure 4. Effects of Compound 5 (A-E) on mRNA transcription. (A) PI-3K mRNA; (B) AKT | mRNA; (C) PEPCK mRNA; (D) G6Pase mRNA; (E) GSK3B mRNA. Compared with the control group,#P < 0.05,##P<0.01,###P<0.001; Compared with the model group, *P< 0.05, **P< 0.01,***P<0.001.
5. PI-3K/AKT信号通路相关蛋白的表达
为了探讨化合物5的降糖作用机制，我们研究了化合物5对PI-3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的影响。细胞经GlcN处理后，PI-3K/AKT信号通路被阻断，PI-3K/AKT下游的糖异生信号通路被间接激活，糖原合成信号通路被抑制，导致IR。在图6中，不同浓度化合物5处理HepG-2细胞后，对AKT和GSK3β蛋白表达水平没有影响，但可以促进PI-3K、p-AKT、GLUT4和p-GSK3β蛋白表达水平，抑制PEPCK和G6Pase蛋白表达水平。结果表明，化合物5可以激活PI-3K/AKT信号通路，促进GLUT4向质膜转移，刺激糖原合成，抑制糖异生，从而改善IR。
Figure 5. Effects of compound 5 (A-G) on protein expression of IR-HepG-2 cell signaling pathway. Compared with the control group,#P < 0.05,###P<0.001. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001. The images of western blots were cropped and made a single exposure, the full-length blots are presented in Figure S55.
Conclusion
从斑花败酱中分离鉴定了6个环烯醚萜类化合物，结构已通过IR、UV、HRMS、1D和2D NMR进行了表征。其中化合物5具有降糖活性，能有效改善HepG-2细胞的胰岛素抵抗，通过Western blotting方法阐明其相关机制，发现化合物5激活PI-3K/AKT信号通路，促进葡萄糖摄取、糖原合成，抑制糖异生。