Introduction
糖尿病已成为严重威胁人类健康的常见慢性非传染性疾病。糖尿病是一种以多种疾病为特征的代谢性疾病，如遗传、环境、代谢紊乱、氧化应激等因素均可引起糖尿病，尤其是2型糖尿病（T2DM）。胰岛素抵抗是导致T2DM的主要原因。已有研究表明，异常的葡萄糖生成、脂质代谢和氧化应激是胰岛素抵抗的重要病理基础，但其分子机制尚不完全清楚。目前，一些临床药物虽然能有效改善T2DM，但人们更想从食品中寻求一些功能成分用来预防和改善T2DM。
食源性生物活性肽作为天然物质，因其安全、副作用低或无毒、易吸收等优点，作为降糖食品或降糖药物被广泛研究。目前，从鲢鱼、蛋黄、大鲵（肉或皮）等多种食品原料中筛选出不同的活性肽。这些肽通过抑制T2DM疾病发生的关键酶的活性，进而发挥改善T2DM的作用。然而，从蛋白水解产物中筛选具有酶抑制作用的活性多肽是一个复杂而耗时的过程，因为它们缺乏靶向性，给后续的细胞实验或体内研究带来了不便。因此，寻找一种靶向筛选活性肽的方法是非常重要的。
网络药理学和生物信息学为药物或药物成分的开发、筛选和疾病治疗提供了新的方法。该方法以整体为基础，收集各种数据库中的药物和疾病信息，结合当前计算机技术，对多成分药物和多病因疾病之间形成的作用网络进行分析，为系统筛选混合物中具有治疗特定疾病能力的化合物及其可能的作用机制提供思路，为后续研究奠定理论基础。
河南科技大学食品与生物工程学院任国艳教授团队采用网络药理学与生物信息学相结合的方法，从鲵皮胶原蛋白水解物中筛选出一种新的改善糖尿病的多肽（GPAGAP），并预测其降糖作用的潜在机制。通过体外IR-HepG2细胞模型实验检测其对细胞糖代谢、脂质代谢及氧化应激水平的影响。本研究旨在为食源性降糖肽的筛选及阐明其改善T2DM的多靶点、多通路机制提供新思路。
Results and discussion
1.鲵皮胶原蛋白水解物降糖肽的筛选
采用LC-MS/MS对鲵皮胶原蛋白水解产物进行鉴定和氨基酸测序。根据Lipinski's规则，从鲵皮胶原蛋白水解产物筛选出一种新的六肽，该肽具有良好的类药性，其氨基酸序列为Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Pro （GPAGAP, Mw = 468.51 Da）。GPAGAP分子结构如图1所示。
2.GPAGAP降糖机制的预测
为了阐释GPAGAP改善T2DM的可能机制，采用网络药理学和生物信息学相结合，筛选GPAGAP与T2DM相关靶点105个，通过GO和KEGG分析，获得GPAGAP作用于T2DM相关靶点和通路，构建“肽-靶点-通路”网络图。拓扑分析结果表明，PIK3CG（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亚基γ）是GPAGAP治疗T2DM的主要靶点。丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白（AKT1）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶、催化亚单位α （PIK3CA）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、丝裂原活化蛋白激酶10 （MAPK10）、Jun原癌基因（Jun）和丝裂原活化蛋白激酶14 （MAPK14）也是相对重要的靶点。这些核心靶点主要富集于PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路IR和TNF信号通路，说明GPAGAP可通过多靶点、多通路治疗T2DM及其并发症。
图2 GPAGAP降糖机制的预测
3.GPAGAP对IR-HepG2细胞糖代谢的影响
糖原是人体能量储存的一种形式，主要存在于骨骼肌和肝脏。因此，糖原合成和糖异生是控制肝脏糖输出的关键因素。HK是糖酵解途径中第一个关键限速酶，激活HK可以增加胰岛素释放和肝脏葡萄糖利用，加速葡萄糖的分解，降低血糖。PK是糖酵解过程中的另一个关键酶，它催化糖酵解的最后一步，将磷酸基从磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转移到二磷酸腺苷（ADP），产生一个丙酮酸分子和一个ATP分子。因此，糖原含量和HK、PK活性的变化可以反映糖代谢的变化。
模型组IR-HepG2细胞的糖原含量、HK活性、PK活性均显著低于正常组HepG2细胞（P < 0.01），说明IR可抑制细胞中糖原合成及HK、PK活性。与模型组IR-HepG2细胞相比，二甲双胍（阳性对照）组和GPAGAP组细胞糖原含量、HK活性和PK活性均显著升高（P < 0.01）。结果表明，GPAGAP能促进糖原合成和糖酵解过程，增强肝脏对葡萄糖的摄取和利用，调节糖代谢，改善细胞IR。
图3 GPAGAP对IR-HepG2细胞糖代谢的影响。
（A）糖原含量；（B）HK活性；（C）PK活性
（与正常组比较，*P < 0.05， **P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05和##P < 0.01）
4.GPAGAP对IR-HepG2细胞脂代谢的影响
脂质过度积累是肥胖和糖尿病的先决条件。结果显示，与正常组HepG2细胞相比，模型组IR-HepG2细胞中TG和TC含量显著升高（P < 0.01），表明IR模型细胞中TG和TC积累，脂质代谢异常。与模型组IR-HepG2比较，阳性对照组和GPAGAP组细胞内TG、TC含量均显著降低（P < 0.01）。结果表明，GPAGAP能抑制IR-HepG2细胞中TG和TC的积累，调节细胞脂质代谢。
图4 GPAGAP对IR-HepG2细胞脂代谢的影响。
（A）TG含量；（B）TC含量
（与正常组比较，*P < 0.05， **P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05和##P < 0.01）
5.GPAGAP对IR-HepG2细胞氧化应激水平的影响
氧化应激是引起IR的重要原因。抑制氧化应激可作为降低血糖、减轻糖尿病并发症的辅助治疗手段。本实验通过检测MDA水平、抗氧化酶（SOD）活性和ROS含量，评估GPAGAP对IR-HepG2细胞氧化应激的影响。如图所示，与正常HepG2细胞相比，模型组IR-HepG2细胞MDA含量、ROS含量极显著升高（P < 0.01），SOD活性极显著降低（P < 0.01），表明IR降低了细胞的抗氧化能力，增加了氧化应激程度。与IR-HepG2组相比，GPAGAP组MDA含量和ROS含量显著降低，SOD活性显著升高，表明GPAGAP可以增强IR-HepG2细胞的抗氧化能力，对细胞氧化应激具有潜在的保护作用。
Conclusion
本研究基于网络药理学和生物信息学，快速高效地从鲵皮胶原水解物中筛选降糖肽GPAGAP，构建“成分-靶点通路”网络模型，多维度、多层次预测并分析了GPAGAP改善T2DM的机制。这为从蛋白水解产物中筛选活性肽并揭示其作用机制提供了理论支持。此外，本研究通过IR-HepG2细胞实验，从改善糖代谢、脂质代谢和氧化应激的角度，评价GPAGAP改善T2DM的作用效果，进一步为GPAGAP改善T2DM的作用机制的阐释提供实验依据。虽然本研究在细胞水平上分析并评价了GPAGAP改善T2DM的潜在机制，但分子水平上的分子机制仍需要进一步的实验研究。
作者简介
通信作者
任国艳，女，河南科技大学食品与生物工程学院教授，硕士生导师，中国营养学会会员，河南省大鲵发展与保护协会副会长。《肉类研究》期刊编委会委员，Food & Function、Food Chemistry等杂志审稿人。近年来主要围绕水（农）产品保鲜与精深加工技术、营养功能组分的识别与挖掘、分子互作及精准递送、功能食品研发与创制等领域开展研究。主持参与国家自然科学基金、国家科技部专项子课题、河南省科技厅、企业委托等科研项目35项。在国内外知名期刊发表学术论文70余篇，其中SCI/EI检索30余篇。授权发明专利20余项，并有效进行成果转化。主编或参编出版著作6部。获河南省教育厅科技成果二等奖1项。
论文网址
https://www.sciopen.com/article/10.26599/FMH.2024.9420010