Introduction
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）、帕金森病（Parkinson's disease，PD）与亨廷顿病（Huntington's disease，HD）等神经退行性疾病（Neurodegenerative diseases，ND）对人类健康带来巨大威胁。随着世界人口老龄化加剧，这些退行性疾病的发病率持续上升。尽管ND最终的临床表现以及分子病理机制各不相同，但在细胞水平上都可以归结为体内神经元的丢失或神经细胞结构和功能的渐进性、退行性变性。由于大脑和脊髓的神经元很难再生，这些细胞水平的改变都是不可逆的。因此，对ND缺少有效的治疗药物，现有药物只能在一定程度上起到改善与缓解疾病症状的作用，并不能促进神经元再生，因此不能真正治疗ND。鉴于干细胞具有自我更新和多向分化潜能，神经干细胞（neural stem cells，NSCs）替代疗法为ND的治疗提供了新的视点和思路。
近年来，外源性NSC移植，包括ESCs（Embryonic stem cell，ESCs）移植、胎儿干细胞（Fetal stem cells，FSCs）移植、诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）移植、骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）移植等已被尝试用于逆转神经组织损伤和恢复神经功能缺陷。尽管NSC移植治疗取得了一些可喜的进展，但是这些治疗策略也面临着诸多挑战，比如免疫排斥、肿瘤形成、伦理争议等。代之而起的一种全新疗法是使用药物直接调控内源性NSC的增殖与分化，这已成为该领域的研究热点。引人瞩目的是，一些营养成分或膳食补充剂，如维生素、酚类化合物、不饱和脂肪酸等，也具有调控NSC和预防ND的潜力。
近20年来，从传统药物出发，发掘抗衰老、抗ND膳食补充剂一直是研究热点。其中，来自传统中药的枸杞子和来自传统印度药的南非醉茄（也称为印度人参）受到广泛关注。枸杞子是茄科（Solanaceae）枸杞（Lycium barbarum）的果实，在中国长期作为膳食补充剂。化学分析表明，枸杞子成分主要包括多糖、生物碱、类胡萝卜素、维生素和一些微量元素。大量药理学研究表明，枸杞子具有抗衰老、抗ND以及神经保护作用。南非醉茄（Withania somnifera，俗称Ashwagandha）作为阿育吠陀中收录的印度传统药物，是目前最广泛使用的膳食补充剂之一，其成分包括生物碱、甾醇、黄酮类化合物等。大量研究发现，南非醉茄具有抗衰老、抗ND、神经保护、线粒体恢复等活性。但迄今对它们是否能够促进NSCs增殖尚属未知。
华中农业大学王刚博士课题组评价了枸杞子和南非醉茄提取物单独或联合应用对NSCs增殖的影响；此外，通过体外构建PD细胞模型，还发现这两种传统药物提取物能减少神经毒性剂引发的神经细胞死亡。研究结果为枸杞子和南非醉茄的潜在神经保护作用提供了证据支持，证明了传统药物在NDs防治中的价值。
Results and discussion
大鼠NSCs体外培养及鉴定
从新生SD大鼠脑组织分离培养的NSCs，在StemPro-NSC SFM完全培养基中培养至第5~7天，可见大量神经干细胞球悬浮生长（图1A）。在传代培养过程中，用StemPro Accutase消化大鼠NSCs，并接种在用纤连蛋白预处理过的培养皿中，以贴壁方式进行培养（图1B）。为了鉴定大鼠NSCs，利用抗Nestin单克隆抗体对贴壁培养的大鼠NSCs进行免疫荧光染色，结果显示，绝大部分细胞都为Nestin阳性（图1C- D），表明培养的大鼠NSCs具有较高的纯度。
图1 大鼠神经干细胞（NSCs）的形态学和免疫荧光鉴定
枸杞子、南非醉茄提取物促进大鼠NSCs增殖
利用超纯水溶解枸杞子提取物（Goji Berry Extract，GBE）或南非醉茄提取物（Withania somnifera Extract，WSE）并过滤除菌，制成储备溶液。将GBE或WSE储备溶液以1/10、1/50、1/250、1/1000、1/5000、1/25000和1/100000的体积比分别添加到StemPro NSC SFM完全培养基中，制备含有不同浓度GBE或WSE的培养基。采用CCK8实验测定不同浓度GBE或WSE对大鼠NSCs增殖的影响。结果显示，培养基中添加了1/1000、1/250或1/50体积GBE的实验孔平均OD450 nm值均显著高于未添加GBE的对照孔（P < 0.05，图2A），其中添加GBE的体积为1/250时，平均OD450 nm值最高；表明添加1/1000、1/250 、1/50浓度的GBE在均能显著促进大鼠NSCs增殖，其中浓度为1/250时具有最佳的促进NSCs增殖效果。此外，WSE在浓度为1/250时，也显示出促进大鼠NSCs增殖的效果（P < 0.05）。不过，GBE或WSE的浓度过高可能会产生毒性，因为添加了1/10浓度枸杞子或南非提取物的实验孔平均OD450 nm值均显著低于未添加这些提取物的对照孔。
进一步分析了GBE和WSE以不同比例复配对大鼠NSCs增殖的影响。根据前述实验结果，选择将含1/250浓度GBE或WSE的StemPro-NSC SFM完全培养基分别以1:0、1:1、1:3或1:9的体积比进行复配，并再次用CCK8法分析了两种提取物以不同比例复配后对大鼠NSCs增殖的影响。结果显示，具有不同GBE和WSE体积比的所有实验组的平均OD450 nm值显著高于没有这些提取物的对照组（P < 0.05，图2B）。值得注意的是，在所有实验组中，0.9（GBE）+ 0.1（WSE）的组合显示出最高的平均OD450 nm值，显著超过了除0.75（GBE）+ 0.25（WSE）和0.5（GBE）+ 0.5（WSE）组合以外的所有其他实验组（P < 0.05）。另一方面，尽管0.75（GBE）+ 0.25（WSE）组和0.5（GBE）+ 0.5（WSE）组的平均OD450 nm值与其他实验组相比没有显示出显著差异，但它们在所有组中的平均OD450 nm值分别排名第二和第三。这些发现表明，向GBE中添加少量WSE对促进大鼠NSCs的生长有更好的效果，表明两种提取物之间可能存在协同效应。
图2 枸杞子、南非醉茄提取物对大鼠NSCs增殖的影响
枸杞子、南非醉茄提取物减少神经毒性剂MPP+导致的神经元死亡
体内神经元的丢失是AD、PD及HD等神经退行性疾病的共有的病理特征。在神经退行性疾病药物筛选研究中，减少神经元死亡是药物潜力的关键指标。ATP是细胞内最重要的能量分子，可以用来衡量细胞新陈代谢水平，并与活细胞数目具有良好的线性关系，通过对ATP 进行定量测定来检测培养物中活细胞数目是药效评价中常用的一种快速检测方法。本文构建了帕金森病（PD）体外细胞模型，并用GBE或WSE进行干预，通过检测细胞ATP水平评估了神经元存活情况。结果显示，与空白组相比，PD模型组细胞ATP水平显著下降，表明神经毒性剂MPP+造成了神经元的死亡；与模型组相比，GBE和WSE干预组细胞内ATP水平显著升高，表明应用GBE或WSE进行干预后，减少了MPP+导致的神经元死亡（图3）。
图3 枸杞子、南非醉茄提取物培提升PD细胞模型ATP水平
Conclusion
本研究通过体外实验发现枸杞子和南非醉茄提取物均有促进神经干细胞增殖的功效，并且两者复配后可能产生更佳的效果；此外，通过构建帕金森病（PD）体外细胞模型，还发现二者能够减少神经毒性剂MPP+导致的神经元死亡，发挥神经元保护效果。作为传统药物及膳食补充剂，枸杞子和南非醉茄的安全性好，长期服用无毒副作用，具有成为ND防治药物的潜力，值得进一步研究和开发。
作者介绍
王刚，男，生物信息学博士在读，主要研究方向为基于系统生物学的促神经再生药物发现；基于进化生物学的肿瘤新靶标发现。近五年主持省卫健委面上项目1项，参与国家自然科学基金、省自然科学基金、生物医学创新专项基金等多项课题；发表论文20余篇，其中SCI论文13篇；参编专著2部；授权发明专利2项。
论文网址
https://www.sciopen.com/article/10.26599/FMH.2025.9420039