Introduction
中药是中华民族数千年的瑰宝，其品质与安全正受到越来越多的重视。然而，中药从种植到临床使用的各个环节均可能存在真菌污染及有害毒素产生的风险。由链格孢菌产生的交替霉素（Alternariol, AOH）已成为影响中药临床用药安全的重要危害因子之一。AOH 毒素具有潜在致癌、致畸及致突变作用，严重威胁人类健康。研究表明，AOH 可通过破坏细胞膜结构、干扰细胞代谢等多种途径造成细胞损伤。此外，该毒素还可导致基因突变和染色体畸变，增加癌症风险。AOH污染问题不仅严重影响药材质量与疗效，甚至危及生命安全。
目前 AOH 检测最常用方法为色谱类技术，包括高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）及液相色谱 - 质谱联用（LC-MS），具有优异的灵敏度与特异性。为保证结果准确性，需通过固相萃取（SPE）等方法对样品进行预处理。非特异性SPE方法由于不能特异性识别AOH导致样品回收率不佳。以抗体为识别元件的免疫亲和柱（IAC）因特异性高、操作简便，在真菌毒素样品预处理中应用广泛，但抗体成本高昂且目前尚无商业化 AOH 特异性抗体，限制了其在中药中AOH 分离富集中的应用。
适配体（Aptamer）是通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选获得的短链单链 DNA（ssDNA）或 RNA，被称为 "化学抗体"，具有亲和力高、特异性强、易合成、成本低及易于修饰（-NH2、-SH 等基团）等优点。适体与靶标可通过范德华力、氢键或电子受体 - 供体相互作用实现特异性结合。
北京城市学院王辉教授团队前期已筛选获得具有优异亲和力与特异性的 AOH 适配体并构建了适体功能化磁性疏水聚合物（MHbPA）用于 AOH 分离富集，虽实现快速吸附与良好回收率，但聚合物合成工艺复杂。而以适配体为特异性识别元件的适体亲和柱（Aptamer affinity column，AAC）具有合成简便、成本低、操作简单及提取效率高等特点。所以本研究构建了 AOH 适配体亲和柱（Alternariol aptamer affinity column，AOH-AAC），将 5' 端氨基 - C6 修饰的适配体共价偶联至 NHS 活化的琼脂糖微球上组装至1mL SPE管。
图1. AOH-AAC工作原理及产品。A：适配体共轭琼脂糖偶联原理；B：AOH-AAC产品；C：AOH-AAC使用流程
Results and Discussion
1. AOH-AAC使用条件优化
经过细致优化后AOH-AAC的最佳净化条件为：含5%乙腈5.0 mL DPBS缓冲液用于上样， 1.0 mL DPBS缓冲液用于清洗AOH-AAC上的非特异性吸附化合物， 1.0 mL甲醇用于AAC上的AOH洗脱，收集洗脱液过滤膜后，进一步进行HPLC-FLD检测。
图2. AOH-AAC使用条件优化。A：上样液中乙腈浓度；B：上样体积。
2. AOH-AAC性能考察
经过对其吸附容量、选择性、使用次数的考察，发现AOH-AAC对AOH的吸附容量可达5μg。选择性如图3 B所示， AOH-AAC对AME的回收率约为75.0%，表明制备的AAC也能对AME吸附，这是由AOH和AME两种结构相似引起的。结果表明，除AME外，AOH-AAC对AOH表现出良好的特异性。连续十次使用AOH-AAC的对AOH的回收率范围在93.4% ~ 117.6%之间，平均回收率为107.0%，RSD值为1.0% ~ 7.0%。结果表明，该AOH-AAC可重复使用10次，且不影响适配体对AOH的结合能力。
图3. AOH-AAC性能考察。A：AAC 对 AOH 的吸附容量、B：选择性；C：使用次数。
3. 实际样品应用
将添加三个浓度水平（4.0、20.0、48.0 μg/g）AOH 标准溶液的中药样品（n=3）经AOH-AAC预处理。通过 AAC 的高效吸附，加标中药样品中的 AOH 含量采用高效液相色谱 - 荧光检测法（HPLC-FLD）进行分析，回收率在 90.22% 至 105.70% 之间（表 1），结果令人满意。这表明 AAC 在实际中药样品分析中用于 AOH 提取纯化的可行性和可靠性。
表1 AOH-AAC中三水平加标的中药样品回收率
Conclusion
通过NHS修饰的琼脂糖与氨基修饰的适配体利用共价方式进行偶联合成了适配体共轭琼脂糖，进而构建了适配体亲和柱。本研究所制备的AOH-AAC在使用条件为含5%乙腈5.0 mL DPBS缓冲液用于上样， 1.0 mL DPBS缓冲液用于清洗AOH-AAC上的非特异性吸附化合物，1.0 mL甲醇用于AAC上的AOH洗脱时，对AOH表现出具有较好的的容量、较高的萃取效率、良好的选择性和优异的重复使用性，被成功应用于实际中药样品中AOH的萃取和纯化，回收率在90.2%至105.7%之间，显示了其在实际样品中应用的可行性和准确性。
作者简介
第一作者
方梦旗，女，汉族，北京城市学院在读硕士，北京市农林科学院联合培养硕士，主要研究方向为中药中真菌毒素检测方法的建立与应用。在国内外期刊公开发表学术论文5篇，其中第一作者论文2篇。
通讯作者
栾云霞，博士/研究员，北京市农林科学院，北京农业质量标准与检测技术研究中心，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（北京）、农产品质量安全追溯技术及应用国家工程实验室（共建），农业投入品评价研究室主任，青年工作委员会副主任，中国科学院天津工业生物技术研究所产业研究员。研究方向是功能核酸生物传感器在小分子靶标检测中的应用研究。主要是基于生物识别分子和纳米材料，研发农产品和农田环境中小分子污染物的生物传感方法和富集纯化装置。近年来，主持和参与国家自然科学基金、十三五重点研发专项、农业部和粮食公益性行业专项和北京市科技计划课题等二十余项。发表研究论文30余篇，其中SCI文章16篇；授权PCT专利1项，国内专利13项，其中发明专利11项，实用新型2项，实施许可转化专利1项；获得软件著作权1项；参编国家标准1项，农业行业标准1项；参编著作4部，“水-土-作物重金属快速检测技术装备与监测平台”获得湖北省科技进步二等奖1项。
王辉，博士，教授，硕士研究生导师，北京城市学院生物医药学部主任，北京市中药学一流本科专业建设点负责人，世界中医药联合会中医药免疫专业委员会理事，北京非物质文化遗产技艺传承协会理事，从事生物医药领域教学及科研工作近20年，作为项目负责人承担国家级、省部级课题四项，作为主要参与者参加国家及省部级教研科研课题十余项，以第一作者或通讯作者发表中英文文章20余篇，其中SCI收录9篇，主编专著一本，获批实用新型专利一项，2017年获广州市科学技术进步奖二等奖。
原文网址：https://www.sciopen.com/article/10.26599/FMH.2026.9420101