该成果以“3-n-Propionyl Zaluzanin C from Saussurea involucrata alleviates inflammation and oxidative stress: potential involvement of the NRF2 signaling pathway”为题，发表在中科院TOP1区期刊Phytomedicine（IF8.3）。
Introduction
炎症是机体清除病原体、维持内环境稳定的基本防御反应。氧化应激是机体内的活性氧与抗氧化防御系统失衡，进而对细胞和组织造成损伤。炎症条件下多种信号转导通路被激活，促炎性基因表达上调，导致炎症介质大量释放，进而破坏氧化还原稳态，最终造成ROS增多。ROS的升高触发NF-κB信号通路激活，促进炎症进程，影响机体平衡。炎症和氧化应激与多种疾病有关，临床常用的抗炎药物和抗氧化药物都存在着许多副作用，且长期用药容易产生耐药性。越来越多的研究者开始关注副作用小、生物利用度好的具有抗炎和抗氧化活性的天然药物。
天山雪莲是菊科植物天山雪莲（Saussurea involucrate (Kar.et Kir.)Sch.-Bip.）的干燥地上部分，广泛分布于新疆、青海、甘肃等地。《中华人民共和国药典》2020年版记载天山雪莲味微苦，性温，具有温肾助阳、祛风胜湿、通经活血的功效。天山雪莲具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、神经保护作用、降血脂等作用，已在现代药理学研究中证实。倍半萜内酯是天山雪莲中主要活性化合物，该类化合物具有抗炎、抗氧化、抗癌和抗病毒等多种药理活性。课题组前期从天山雪莲中分离得到一系列倍半萜内酯类化合物。在对该类化合物进行活性筛选时发现，天山雪莲倍半萜内酯类化合物具有抗炎抗氧化作用。
本课题研究对象是天山雪莲的一种新化合物NPZC，活性初筛发现NPZC可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中NO的释放，抗炎活性较好，同时具有清除H2O2诱导的HepG2细胞ROS能力，而NPZC抗炎抗氧化作用机制和作用靶点尚未报道。因此本课题对天山雪莲中的NPZC特征结构以及与其结构相似的倍半萜内酯进行网络药理学研究，并结合体外细胞试验验证潜在抗炎靶标。而文献调研发现与天山雪莲提取物相关的斑马鱼体内实验鲜见报道，为了更深入了解NPZC的药理活性，更好评价其抗炎抗氧化作用机制，本实验采用斑马鱼模型对NPZC的抗炎、抗氧化作用进行评价，以期为天山雪莲倍半萜内酯的临床应用提供实验依据。
图1 化合物的结构（A）、化合物NPZC的1H-1H COSY和HMBC (B)、ROESY (C)以及化合物NPZC的ECD曲线（D）
图2 NPZC对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6、TNF-α分泌量（C、D）及其mRNA表达量（E，F）的影响，NPZC对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX-2 mRNA表达量（G，H）及蛋白水平的影响（I）
图3 NPZC对HepG2细胞活力的影响（A），NPZC对H2O2诱导的HepG2细胞线粒体膜电位水平（B）、ROS含量（C，D）、抗氧化酶CAT（E）、SOD（F）、GSH（H）和MDA（G）水平的影响
图2结果表明，天山雪莲中的新倍半萜内酯类化合物NPZC（5~20 μM）能够有效调控LPS刺激导致的RAW264.7细胞炎症反应。开展抗炎活性研究，发现NPZC能够抑制炎症因子产生（IL-6和TNF-α等）。而评判化合物NPZC的抗氧化效果（图3），结果表明,不同浓度的NPZC处理对H2O2诱导的HepG2细胞抗氧化酶活力的影响，发现40、20 μM浓度的NPZC也能升高H2O2诱导HepG2细胞中CAT、SOD和GSH活力，同时降低MDA产生，减少细胞内的氧化应激。
图4 NPZC对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB信号通路中的p-P65/P65（B）、p-IκBα/IκBα（C）蛋白水平的影响（A）。TNF-α处理对RAW264.7细胞NF-κB信号通路中的p-P65（E），p-IκBα（F）蛋白表达的影响（D），TNF-α处理后，RAW264.7细胞分泌IL-6（G）、TNF-α（H）含量及其mRNA（I，J）表达量
图5 NPZC对LPS诱导的RAW264.7细胞Nrf2信号通路的影响（A），ML385处理对RAW264.7细胞Nrf2蛋白水平（B），IL-6（C）、TNF-α（D）含量及其mRNA（E，F）表达量的影响
图4、图5结果表明，NPZC可以调控LPS刺激的RAW264.7细胞的NF-κB信号通路，同时通过促进Nrf2进入细胞核、增加HO-1和NQO1的表达，激活Nrf2信号通路，从而发挥抗炎作用。在上述研究基础上，利用ML385（Nrf2抑制剂）和TNF-α（NF-κB激活剂）处理LPS刺激的RAW264.7细胞，发现NPZC主要通过激活Nrf2通路，降低炎症因子IL-6和TNF-α的表达，发挥抗炎作用。
图6 敲低Nrf2对Nrf2（B）和Nfkb（C）mRNA表达量，IL-6（D）和TNF-α(E)分泌含量，NPZC与Nrf2和Keap1蛋白结合能力检测（F）
探讨敲低Nrf2蛋白对NF-κB信号通路的影响，发现敲低Nrf2能促进LPS刺激下RAW264.7细胞炎症因子IL-6和TNF-α的分泌水平，并且激活NF-κB信号通路，与文献结果一致，并且NPZC处理可缓解Nrf2敲低下LPS刺激引发的炎症反应，抑制炎症因子产生，表明Nrf2是NPZC发挥抗炎作用的关键蛋白。
图7 NPZC对LPS诱导的斑马鱼胚胎心率（A）、卵黄囊面积（B、K）、NO（C）和ROS（L）含量的影响。NPZC对LPS诱导的斑马鱼炎症因子tnfα（A）、il6（B）和cox2（C）mRNA表达量的影响。NPZC对LPS诱导的斑马鱼cat（D）、sod（E）、gpx1（F）和nrf2（G）mRNA表达量的影响
图8 NPZC对斑马鱼胚胎存活率（A）、心率（B）和卵黄囊面积（C、D）的影响。NPZC对AAPH诱导的斑马鱼nrf2（E）、ho1（F）、nqo1（G）、cat（H）、sod（I）和gpx1（J）mRNA表达量的影响。不同浓度NPZC对AAPH诱导的斑马鱼体内细胞凋亡（K）、活性氧生成率（L）的影响
研究发现LPS诱导斑马鱼经NPZC处理后，可以使幼鱼心率减慢进而恢复到正常，缓解LPS刺激引起的毒性反应、减小炎症斑马鱼卵黄囊面积、抑制斑马鱼体内NO和ROS的生成。而且发现NPZC可以通过抑制LPS诱导的斑马鱼tnfα、il6和cox2的mRNA表达量发挥抗炎作用，并调节Nrf2信号通路，上调LPS诱导的斑马鱼cat、sod、gpx1和nrf2的mRNA表达量，从而避免炎症引起的氧化损伤，发挥保护作用。通过斑马鱼体内氧化应激模型，确定了NPZC（12.5~50 μM）可以清除AAPH诱导的斑马鱼ROS，保护斑马鱼活体细胞，上调Nrf2通路相关基因nrf2、ho1和nqo1表达，进而提高AAPH诱导的斑马鱼cat、sod和gpx1的mRNA表达量缓解氧化损伤，发挥抗氧化作用。
Conclusion
本研究系统阐明了从天山雪莲中分离得到的活性化合物NPZC的作用机制，NPZC主要通过增强NRF2信号通路的热稳定性来提高细胞抗氧化防御能力，进而抑制NF-κB介导的炎症反应，打破炎症与氧化应激的恶性循环。这一发现不仅为天山雪莲的传统药效提供了现代科学解释，同时也为开发以Nrf2为靶点的天然抗炎和抗氧化药物提供了新的候选化合物及理论依据。
通讯作者
康文艺，国家食用菌加工技术研发专业中心主任，二级教授，博士生导师，国家重点研发计划首席科学家，河南省高层次人才（B类）。主持国家重点研发计划、国家自然科学基金、国家市场总局保健食品专项等40余项；以第一作者或通讯作者在Food Science and Human Wellness、Carbohydrate Polymers、Acta Pharmaceutica Sinica B 等杂志上发表SCI论文133篇，近五年授权中国发明专利33件。以第一完成人获得中国商业联合会科学技术奖特等奖，中国商业联合会科学技术奖一等奖，河南省科学技术进步奖二等奖2项，中国技术市场协会金桥奖第四届三农科技服务金桥奖项目二等奖；以参与完成人获得国家市场监督管理总局科研成果一等奖，河北省科学技术进步奖二等奖等奖励，以及获得河南省优秀研究生指导教师等荣誉。
张于，中国科学院昆明植物研究所，研究员/博士研究生导师，美国北卡罗莱纳大学教堂山分校药学院访问学者，中国科学院青年创新促进会会员、中国科学院西部之光-西部青年学者、云南省中青年学术和技术带头人、云南省兴滇英才支持计划入选者。主要从事药/食用植物中天然产物结构、活性、作用机制及成药性研究。目前以第一或通讯作者在Natural Product Reports, Organic Letters, Protein & Cell, Journal of Natural Products, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Phytochemistry等权威期刊发表SCI论文70余篇，第一发明人授权发明专利10项；主持国家重点研发计划课题、中国科学院战略性先导B专项课题、国家自然科学基金面上、云南省应用基础研究计划重点、中国科学院西部之光等10余项基金，先后获云南省自然科学一等奖和广西自然科学二等奖。目前受邀担任Food & Medicine Homology副主编，中国科学院1区期刊Food Science and Human Wellness，Natural Products and Bioprospecting编委。
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