该成果以“Isobavachromene ameliorates insulin resistance via inactivating the MAPK/NF-κB signaling pathway” 为题发表在中科院TOP 1区期刊Food Science and Human Wellness杂志（IF 5.6）。
Introduction
胰岛素作为一种重要的生物活性物质，在人体外周和中枢组织的能量产生、代谢以及细胞存活和增殖中起着至关重要的作用，胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）会加剧2型糖尿病（T2DM）的发生和发展。肥胖是IR的主要驱动因素，也会导致T2DM患病率增加。作为胰岛素的关键靶组织，脂肪组织中的慢性炎症是导致IR发生和发展的核心因素。 研究表明，从天然产物中提取的活性成分可通过不同途径增加胰岛素的敏感性，对IR具有一定的改善作用。因此，我们从补骨脂中分离出一种异补骨脂色烯查尔酮（Isobavachromene，IB），这是一种已报道具有抗菌活性的类黄酮，但IB是否以及如何改善葡萄糖稳态和胰岛素抵抗仍是未知的。本研究通过观察IB对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响以及对RAW 264.7巨噬细胞和3T3-L1脂肪细胞炎症反应的影响，探讨IB通过降低脂肪细胞炎症反应从而改善IR的作用机制。
Results and discussion
1.IB改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗
为明确异补骨脂色烯查尔酮（IB，图1A）是否能改善胰岛素抵抗（IR），作者首先评估了其对3T3-L1脂肪细胞的影响。MTT试验显示，IB在25 - 100 µM浓度范围内无细胞毒性（图1B）。在3T3-L1脂肪细胞中成功建立IR模型后，作者发现IB显著促进脂肪细胞的葡萄糖摄取能力（图1C）。此外，IB显著增强了GLUT4的转运（图1D），且效果优于阳性对照原钒酸钠。此外，通过分子对接预测IB在胰岛素受体的Arg 118和Phe 64位点具有良好的结合能。为阐明IB在脂肪细胞中的降糖机制，作者发现IB激活了IRS-1/PI-3K/Akt轴，显著增加PI-3K（P110α）的表达以及IRS-1和AKT的磷酸化水平，最有效浓度为50 μM（图1E）。为进一步验证此结果，作者使用了特异性通路抑制剂Wortmannin，并检测了PI-3K（P110α）和AKT的表达水平（图1F）。结果表明，IB可通过激活PI-3K/AKT信号通路改善3T3-L1脂肪细胞的IR。
图1 IB通过IRS-1/PI-3K/Akt信号通路改善3T3-L1脂肪细胞中的胰岛素抵抗（IR）。
(A) 异补骨脂色烯查尔酮（IB）的化学结构。(B) IB对3T3-L1脂肪细胞活力的影响。(C) IB对3T3-L1脂肪细胞上清液中葡萄糖含量的影响。(D) Western blot检测IB对GLUT 4的影响。(E) IB对IRS1/PI3K/Akt相关蛋白表达的影响。(F) IB对通路抑制剂Wortmannin（Wort，100 nM）作用后PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响。
2.IB对RAW 264.7巨噬细胞炎症水平的影响
胰岛素抵抗（IR）通常伴有慢性炎症状态。因此，作者使用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型，进一步研究了IB的抗炎作用。MTT试验显示，IB在25-100 µM浓度范围内无细胞毒性（图2A）。在50 μM剂量下，IB显著降低了一氧化氮（NO）（M1巨噬细胞的标志物）（图2B）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS，图2C）的分泌。此外，炎症因子TNF-α的产生增加对肥胖个体中IR的产生具有重要影响，作者发现IB显著降低了TNF-α的分泌能力（图2D）和转录水平（图2E）。IL-6（图2F，G）和IL-1β（图2H，I）（细胞因子风暴中的关键分子）也被IB显著降低。以上结果表明，IB对RAW264.7巨噬细胞具有良好的抗炎作用。
图2 IB对LPS诱导的炎性巨噬细胞的影响。
(A) IB对RAW 264.7巨噬细胞活力的影响。(B) 硝酸还原酶法测定IB对RAW264.7巨噬细胞NO分泌的影响。(C) RT-qPCR检测IB对RAW 264.7巨噬细胞中iNOS表达的影响。（D，E）IB对RAW 264.7巨噬细胞中TNF-α分泌及mRNA水平的影响。（F，G）IB对RAW264.7巨噬细胞中IL-6分泌及mRNA水平的影响。（H，I）IB对RAW264.7巨噬细胞中IL-1β泌及mRNA水平的影响。
3.IB通过MAPK/NF-κB信号通路抑制RAW 264.7巨噬细胞中的炎症水平
MAPK和NF-κB在炎性反应中发挥重要作用。在确定了IB具有良好抗炎作用的基础上，作者试图阐明其抗炎机制。通过Western blot发现IB显著抑制RAW 264.7巨噬细胞中P38、ERK和JNK蛋白的磷酸化（图3A）。此外，TNF-α水平升高表明NF-κB可以通过复合物p65成分的核转位激活炎症基因。因此，作者进一步研究了IB对NF-κB信号通路的抗炎特性。观察到IB显著抑制RAW 264.7巨噬细胞中NF-κB和iκB的磷酸化（图3B），以及NF- κB的核转位（图3C）。这些结果表明，IB通过MAPK/NF- κB信号通路抑制LPS诱导的炎症。
图3 IB通过NF-κB和MAPK信号通路抑制RAW 264.7巨噬细胞中的炎症水平。
（A）通过Western blot分析IB对MAPK信号传导途径相关蛋白表达的影响。(B)通过Western blot分析IB对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。(C)用激光共聚焦显微镜观察IB对p65核转位的影响。
4.IB改善3T3-L1脂肪细胞中炎症导致的胰岛素抵抗
为阐明3T3-L1脂肪细胞中炎症和IR之间的因果关系。作者首先使用倒置显微镜捕获Transwell小室的图像，发现IB抑制RAW 264.7巨噬细胞向脂肪细胞的浸润（图4A）。MCP-1和MIP-1α是肥胖脂肪组织中巨噬细胞增殖的潜在刺激因子，可导致脂肪细胞炎症，作者发现IB显著降低了这些趋化因子的分泌（图4B）及转录水平（图4C，D），以及脂肪细胞中TNF-α诱导的IL-6（图4E）和IL-1β（图4F）的转录水平。 此外，COX2是炎症反应中常见的诱导酶，其转录（图4G）和蛋白质表达水平（图4H）也被IB显著抑制。
图4 IB通过抗炎调节3T3-L1脂肪细胞的IR。
(A) IB对RAW 264.7巨噬细胞向3T3-L1脂肪细胞迁移的影响。(B) IB对MCP-1分泌的影响。（C，D）RT-qPCR以检测IB对3T3-L1脂肪细胞中MCP-1和MIP-1α表达的影响。（E，F）通过RT-qPCR定量3T3-L1脂肪细胞中IL-6和IL-1 β的mRNA表达。(G) RT-qPCR检测IB对3T3-L1脂肪细胞中COX-2 mRNA水平的影响。 (H)Western blot检测3T3-L1脂肪细胞中COX-2蛋白的表达水平。
5.IB影响炎性3T3-L1脂肪细胞中的MAPK/NF-κB信号通路
在明确IB改善由炎症引起的IR后，作者试图进一步阐明其机制。使用Western blot发现IB（25-50μM）显著降低了NF- κB的磷酸化水平（图5A），以及JNK的磷酸化水平（图5B），进一步表明IB通过MAPK/NF-κB信号通路改善炎性3T3-L1脂肪细胞中的胰岛素抵抗。
图5 IB调节炎性3T3-L1脂肪细胞中的MAPK/NF- κB信号通路。
（A）IB降低3T3-L1脂肪细胞中NF-κ B的磷酸化水平。（B）IB降低3T3-L1脂肪细胞中JNK的磷酸化水平。
Conclusion
本研究阐明了IB改善巨噬细胞炎症以及脂肪细胞中炎症导致胰岛素抵抗的机制。作者发现IB通过抑制NF-κB和MAPK信号通路改善炎症，从而增强受炎症影响的胰岛素敏感性。以上内容为IB相关降糖药物的开发提供了基础。