• 桑椹中的氧化白藜芦醇保护CCl ₄ 引起的大鼠肝纤维化
• 减少氧化损伤，抑制造血干细胞的活化
• 下调TGF-β1、p-Smad1/2和p-ERK1/2的表达水平
• α-SMA、desmin、MMP2和MMP9的mRNA转录水平降低
  氧化白藜芦醇比白藜芦醇更有效地保护肝纤维化
  Introduction

  氧化白藜芦醇（ORes），反式-2,4,3′,5′-四羟基茋，存在于桑树等桑科植物中，也存在于葡萄、花生等植物中。与白藜芦醇（Res）相比，它在1,2-二苯乙烯骨架（二苯乙烯）的2位上多了一个羟基，延长了富电子的共轭系统，使其比Res更容易被氧化，因此ORes的抗氧化活性比Res强。在过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞（HLECs）的氧化应激和凋亡中，ORes的抗氧化和清除自由基活性得到了证明，其中ORes有效地抑制了蛋白激酶B（Akt）/血红素氧酶-1（HO-1）通路的激活，从而保护了H₂O₂引发的白内障。ORes还表现出对啮齿动物炎症的抑制作用，以及通过血管生成和淋巴结转移对肝癌的抗肿瘤活性。有几项关于ORes肝脏保护作用的研究，如通过AMPK途径抑制肝脏脂肪生成，改善非酒精性脂肪肝疾病，消除过氧化氢叔丁基（tBHP）诱导的HepG2细胞的氧化应激，以及预防四氯化碳（CCl₄）诱导的小鼠急性肝损伤，保护脂多糖（LPS）或D-半乳糖胺（D-GaIN）诱导的急性肝损伤，通过抑制核因子kappa B（NF-κB）的通路和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，上调小鼠体内抗氧化酶、核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）、NADH秦酮氧化还原酶（NQO1）和HO-1的表达水平。

  CCl₄诱导的肝纤维化动物模型是啮齿类动物中的常用方法。前期研究发现，ORes、Res和另一种膳食中的茋类化合物对CCl₄诱导的大鼠肝纤维化有抑制作用。Res能有效防止慢性治疗大鼠NF-κB的激活和转化生长因子-β1（TGF-β1）的增加。反式-2,3,5,4′-四氢二苯乙烯2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷是中草药植物何首乌中的一种优势二苯乙烯植物化学物，由于其对α-平滑肌动蛋白（α-SMA）、TGF-β1的抑制作用，通过降低HSC活化水平，缓解CCl₄诱导的大鼠肝纤维化。然而，ORes的疗效和机制，特别是其与Res在预防肝纤维化方面的直接比较仍不清楚。因此，中南林业科技大学的Guliang Yang、黄冈师范学院经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室的Jianfeng Zhan、Shiming Li等在本研究旨在探讨ORes对CCl₄诱导的大鼠肝纤维化的预防作用和分子机制，并比较ORes和Res的抗纤维化活性。

  
  

  

为了研究ORes是否具有抗纤维化作用，本研究采用H&E染色和天狼猩红染色法对肝脏纤维化进行病理检查。H&E染色（图1A）和天狼猩红染色（图1B）结果表明，IP注射CCl₄诱导的肝脏损伤严重，表现为肝细胞的炎症、变性和坏死。在肝组织中还检测到严重的胶原蛋白堆积。但肝脏纤维化的标志物，如炎症细胞的坏死和大血管脂肪化浸润，以及肝细胞的再生结节等，在用水飞蓟素、ORes或Res治疗组大鼠中得到了有效的改善，如图1B所示，与CCl₄治疗大鼠相比，用水飞蓟素、ORes或Res治疗后，肝脏纤维隔膜程度显著降低，这与H&E结果一致。METAVIR分级评价的结果表明，与CCl₄治疗组相比，用水飞蓟素、ORes或Res治疗后，肝纤维化的S3期急剧减少，S2期增加（图1C）。通过分析天狼猩红染色的成像结果，CCl₄治疗组大鼠增厚的肝隔膜纤维化变薄，胶原蛋白沉积明显减轻（图1D）。综上所述，与CON组相比，CCl₄处理后大鼠肝脏组织中胶原蛋白的分泌量明显增加，ORes或Res共同处理后，肝脏中胶原蛋白的积累明显减少。因此，用水飞蓟素、ORes或Res治疗可有效预防肝纤维化。

图1  肝组织的H&E染色和天狼猩红染色法

普洱茶、洋葱等提取物已被证实可以减少氧化应激，发挥保肝作用。为了解决ORes是否能改善肝功能，对CCl₄引起的肝损伤有预防作用，接下来进行了血清酶学试验。为了评价实验大鼠的肝功能，使用相应的检测试剂盒测定ALT和AST的水平。如图2A所示，与CON组相比，CCl₄处理的大鼠血清ALT和AST活性显著增加。然而，这些ALT和AST水平的增加在水飞蓟素、ORes或Res的干预下明显减弱。

图2  血清酶学试验

肝纤维化大鼠的氧化状态也得到改善，血清中MDA、GSH和SOD等反映体内氧化损伤程度的典型生物标志物水平。用CCl₄处理的大鼠GSH含量和SOD酶活性降低，而应用ORes、Res或水飞蓟素可有效地使GSH和SOD等防御性抗氧化指标恢复到接近正常水平（图2B）。肝组织中的脂质在细胞色素P450系统代谢CCl₄后，由于体内三氯甲基过氧自由基（–OOCCl₃）分离出脂质氢原子而被过氧化，随后产生大量的ROS。因此，MDA是脂质过氧化作用的产物，肝脏MDA水平升高反映了脂质过氧化作用的增强。如图2A所示，CCl₄处理组大鼠血清MDA浓度较CON组增加14倍，但MDA水平明显下降。但ORes或Res剂量为100 mg/kg或300 mg/kg，水飞蓟素为200 mg/kg处理组的MDA水平明显下降。

血红素氧合酶1（HO-1）是HO的诱导形式和强大的自由基清除剂，在保护氧化应激介导的损伤中起着重要作用。CCl₄刺激大鼠HO-1蛋白的相对表达水平较CON组增加3.23倍（图2C），说明CCl₄刺激了大鼠肝组织的氧化损伤。用ORes或Res经口灌胃（PO）300 mg/kg BW处理CCl₄大鼠，HO-1的值比CCl₄处理组分别降低到0.68和0.51倍（图2C，2D），说明ORes和Res均能减轻CCl₄引起的肝脏氧化损伤，对肝脏起到重要的保护作用。同时也证明ORes是HO-1的强抑制剂，即在保护CCl₄诱导的肝脏氧化损伤方面比Res有更好的抗氧化作用。

CCl₄处理引起大鼠肝脏组织的氧化损伤。在诱导的氧化应激作用下，损伤的肝脏分泌一些促炎细胞因子，如TGF-β1、TNF-α和IL-17。受伤肝细胞和巨噬细胞库普弗细胞释放的促炎细胞因子在推动纤维化过程中发挥了重要作用。因此，下调相关细胞因子的活性可以抑制肝纤维化的发生。由于TGF-β1在激活HSCs方面起着至关重要的作用，因此抑制TGF-β1被认为是防治肝纤维化的有效策略。在确定了ORes保护肝功能方面的抗氧化活性后，进一步用ELISA法测定了血清促炎细胞因子TNF-α、IL-17和TGF-β的水平（图3）。与CON组相比，CCl₄刺激后TNF-α、IL-17和TGF-β的水平分别显著升高了5.97、3.59和3.57倍。但灌胃喂养ORes和Res后，这3种细胞因子的水平明显降低，特别是在高剂量（300 mg/kg）喂养ORes和Res后，这3种血清细胞因子的水平降低到接近水飞蓟素或普通饲料组的水平。因此，ORes和Res抑制了CCl₄引起的肝脏炎症，防止了肝纤维化的形成。

图3  ELISA法检测血清中TNF-α、IL-17和TGF-β

综上所述，氧化白藜芦醇表现出降低肝脏氧化损伤、缓解CCl₄引起的纤维化的生物学效应。据考证，ORes对氧化应激的降低作用比Res强。ORes通过抑制TGF-β1、p-Smad1/2和p-ERK1/2的过度表达，激活HSCs和肝组织中胶原蛋白的积累，达到预防肝纤维化的作用。因此可以得出结论，从饮食中摄取含有氧化白藜芦醇的水果或食品，尤其是桑椹，对肝纤维化有预防作用。但在不久的将来，还需要进行人体研究，以全面了解氧化白藜芦醇逆转肝纤维化的细胞和分子机制，并为以氧化白藜芦醇为生物活性标志物的食品提供指导。

阅读原文