该成果以“Structural characteristics, anticoagulant and antithrombotic mechanism of a novel polysaccharide from Rosa Chinensis Flos” 为题发表于Food Science and Human Wellness杂志（IF：8.022）。
Introduction
天然植物产品作为目前食品和饮料市场的重要组成部分，其中食用花卉食品和饮料配方因健康益处和独特的花香风味而深受消费者喜爱。月季花始载于《本草纲目》，能“活血，消肿，敷毒”；《泉州本草》：“通经活血化瘀，清肠胃湿热，泻肺火，止咳，止血止痛，消痈毒”。此研究鉴定得到的月季花多糖RCJ2-Ib，结构解析表明为聚甘露糖醛酸。同时，《中华人民共和国药典》2015年版一部中记载“月季花具有活血调经、疏肝解郁的功效，用于气滞血瘀、月经不调、痛经、闭经和胸胁胀痛”，而且前期的活性初筛发现月季花粗多糖具有良好的抗凝血活性。基于此，拟对RCJ2-Ib抗凝血机制进行研究。此外，植物多糖已被证实可以提高肠道粘膜免疫水平，为探究月季花多糖RCJ2-Ib对肠道菌群的影响，同时开展了RCJ2-Ib对肠道菌群的作用。
本中心自2017年起对月季花开展系统研究，从中分离得到了16个化合物，为全面系统了解月季花的化学成分，集中研究月季花中所含的多糖类成分，包括其提取、分离、纯化、结构表征，以及多糖组分的凝血活性及作用机制，以期为月季花的深入研究奠定基础。
Results and Discussion
1. 月季花多糖的提取、分离和纯化
Fig.1a为月季花多糖的提取分离流程图。月季花经脱脂、水提醇沉、除蛋白、淋洗后得到月季花粗多糖RCJ，得率为3.2%。经DEAE-52分离得到4个多糖组分（Fig.1b），分别是0.00 mol/L NaCl部分（RCJW），0.05 mol/L NaCl（RCJ1），0.10 mol/L NaCl 部分（RCJ2）和0.15 mol/L NaCl部分（RCJ3）。选择得率最高的RCJ2再次经DEAE-Sepharose FF阴离子交换色谱柱纯化后（Fig.1c），得到RCJ2-I（得率16.7%）和RCJ2-II（得率2.5%）。RCJ2-I 经Sephadex G100纯化后得到得率为58.7%的RCJ2-Ib。
Fig.1 The total extraction process of RCJ2-Ib (a); Elution of RCJ (b) and RCJ2 (c) by ion exchange column chromatography. RCJ represents the crude polysaccharide extract from Rosa Chinensis Flos.
2. 月季花多糖的分子量和单糖组成测定
多糖是一类大分子聚合物，分子量仅代表相似链长的平均分布。常用重均分子量（Mw）表示多糖的实际分子量，分散指数（Mw/Mn）判断多糖纯度及分子量分布。由HPSEC 检测后计算（Fig.2a），RCJ2-Ib的重均分子量分别为3.3 kDa，分散指数为1.117。
GC检测水解和乙酰化后的月季花多糖单糖组成，RCJ2-Ib的单糖分析如Fig.2b所示，RCJ2-Ib单糖组成单一，由大量甘露糖构成。
Fig.2 HPSEC chromatograms of RCJ2-Ib (a). GC chromatograms showing the monosaccharide profiles of a reference mixture of standard monosaccharides and RCJ2-Ib (b). RCJ2-Ib represents a fraction of the crude polysaccharide extract from Rosa Chinensis Flos.
3. 月季花多糖的FI-IR光谱
由Fig.3知，RCJ2-Ib在3393.1 cm-1处有特征吸收峰，研究发现O-H的伸缩振动在3600.0～3200.0 cm-1表现出一种宽而大的峰，N-H也在这个区域有伸缩振动，因此判断，在该糖中可能存在O-H和N-H，而在1560.0～1508.0 cm-1处无红外吸收，说明RCJ2-Ib在红外光谱3393.1 cm-1处出现的特征吸收峰为O-H的伸缩振动；在2934.1 cm-1处有一特征吸收峰，这是分子中C-H键的变角振动引起，这两处的吸收峰是多糖的特征吸收峰。2369.6 cm-1处对应的峰是脂肪族C-H所延伸的弱信号。
1657.5 cm-1处的吸收峰为羧基上O-C=O非对称伸缩振动，1416.4 cm-1处的吸收峰为去质子化羧基-COOH的伸缩振动， RCJ2-Ib在此处有吸收，因此推断结构中含有糖醛酸；RCJ2-Ib在1144.5 cm-1处吸收峰为吡喃环上的C-C-H和O-C-H的变角振动，1109.7 cm-1和1020.6 cm-1处的吸收峰表示C-O在拉伸模式下以吡喃糖形式的弯曲振动；1027.4cm-1处吸收峰对应于吡喃环的振动；碳水化合物的α和β构象可由950.0～750.0 cm-1区域中末端碳的峰位确定，其中870.0～840.0 cm-1对应于α构型，β构型为890.0 cm-1左右的吸收峰。表明RCJ2-Ib既含有α构型又含有β构型。
Fig.3 Infrared spectrum of RCJ2-Ib. The inset shows the partial structure of RCJ2-Ib, a fraction of the crude polysaccharide extract from Rosa Chinensis Flos.
4. 月季花多糖的NMR
Fig.4为RCJ2-Ib 的1H-NMR和13C-NMR图谱。糖的质子信号均集中在δH 3.40～5.50 ppm的范围内，异头氢的化学位移集中在δH 4.50～5.50 ppm，其中，α型糖苷键的异头质子大于δH 5.00，β型小于δH 5.00。根据异头氢的个数和质子信号值推断糖苷键的类型和数目。
从1H-NMR（Fig.4a）可以看出，RCJ2-Ib 中有6个质子信号，在δH﹥4.50 ppm的低场区只有一个质子信号，其化学位移为5.07 ppm，结合1H-1H COSY谱(Fig.4d)，推测H-2，H-3，H-4和H-5的化学位移分别为3.77，4.01，4.42，4.77 ppm。
在13C-NMR图谱中，δC 101.8 ppm处的化学位移是在δC 98.0 -110.0 ppm范围内唯一检测到的信号，因此RCJ2-Ib仅具有一个异丁烯构型的异头碳。δC 101.8 ppm处表明甘露糖中的碳吸收信号。根据1H-NMR和13C-NMR，虽然不能排除以α和β形式同时存在糖苷键，但仍确认存在甘露聚糖β-端基异构体。中心位于约δC 178.3 ppm的低场信号，源自糖醛酸的C-6。结合HSQC谱（Fig.4c），可推出C-2，C-3，C-4和C-5相应的13C化学位移分别为70.9，71.7，80.7，74.1 ppm。初步判断RCJ2-Ib为1,4连接的聚甘露糖醛酸。
RCJ2-Ib重复单元中糖残基之间的连接方式和链接顺序可以通过HMBC图谱(Fig.4e) 来判断和验证。根据HMBC谱中H-1（δH 5.07）和C-4（δC 80.7）相关，H-5与δC 178.3相关，表明RCJ2-Ib为β-D-1,4-连接的聚甘露糖醛酸。
Fig.4 NMR analyses of RCJ2-Ib. a. 1H NMR spectrum (600 MHz); b. 13C NMR spectrum (125 MHz); c. 1H-13C HSQC spectrum; d. 1H-1H COSY spectrum; e. 1H-13C HMBC spectrum. RCJ2-Ib represents a fraction of the crude polysaccharide extract from Rosa Chinensis Flos.
5．月季花多糖的体外抗凝血活性
月季花多糖RCJ和RCJ2-Ib体外抗凝血活性结果见Table 1。从Table 1中可以看出，与空白组相比，RCJ、RCJ2-Ib和灯盏花素均能极显著延长APTT和TT的作用时间（P < 0.001），极显著降低FIB的含量（P < 0.001），初步推断RCJ和RCJ2-Ib多糖组分均能通过内源性凝血途径和降低血浆中纤维蛋白原的含量来抑制血液的凝固而发挥良好的抗凝血活性。为进一步确定月季花多糖的抗凝血作用机制，选择得率较高的RCJ2-Ib做了进一步的体内抗凝血活性。
Table 1 Evaluation of plasma coagulation parameters (affected by RCJ or RCJ2-Ib) using the blood from rabbit auricular veins (X ± standard deviation, n = 3)
6. RCJ2-Ib对大鼠体内凝血因子的影响
Table 2中，与空白组相比，模型组的APTT、PT和TT均极显著缩短（P < 0.001），而FIB极显著升高（P < 0.001），说明大鼠急性血瘀模型造模成功。与空白组相比，模型组大鼠血清中6-keto-PGF1α的含量极显著降低（P < 0.001)，TXB2的含量极显著升高(P < 0.001)，说明大鼠急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，RCJ2-Ib高、中剂量组均可极显著地升高6-keto-PGF1α的含量(P < 0.001)，降低TXB2的含量（P < 0.001)，且对6-Keto-PGF1α/TXB2有显著的平衡作用（P < 0.01)；RCJ2-Ib低剂量组对6-keto-PGF1α和TXB2的含量无显著性差异影响（P > 0.5）。TXB2和6-keto-PGF1α分别是血栓素A2(TXA2)和前列腺环素(PGI2)的代谢产物。
Table 2 Evaluation of anticoagulant/antithrombotic effect of RCJ2-Ib using an acute blood stasis rat model (`x ± standard deviation, n = 6)
与空白组相比，模型组的大鼠血清中eNOS的含量被极显著地降低(P < 0.001)，而ET-1的含量极显著的升高(P < 0.001)，说明大鼠的急性血瘀模型造模成功。ET和NO是互相对立的生物活性因子，在调节心血管系统方面起着重要的作用，参与多种心血管疾病的病理过程。
HCT是影响血液粘度的最主要因素，HCT越高则血液粘度越大。而红细胞间的聚集力是影响ESR速度最重要的因素，红细胞间的聚集力越大，ESR就越快，反之则慢。与空白组相比，模型组的ESR和HCT均极显著提高（P < 0.001），说明大鼠急性血瘀模型造模成功。与模型相比，RCJ2-Ib高、中剂量组均极显著降低鼠ESR和HCT（P < 0.001），低剂量组显著降低HCT（P < 0.01）。与空白组相比，模型组的PV以及在200 s、30 s和3 s频率下的WBV均极显著提高（P < 0.001），说明大鼠急性血瘀模型造模成功。与模型组相比，RCJ2-Ib的高、中剂量组可极显著降低PV（P < 0.001），显著降低在各个频率下的WBV（P < 0.01）。由此推测，RCJ2-Ib通过降低WBV和PV，进而抑制血栓形成。
7. 月季花多糖在属水平上的组间菌群差异性
根据样品在属水平丰度信息和物种注释，本研究绘制物种相对丰度分布柱状图和热图（Fig.5）。由Fig.5知，HD、MD、LD组的大鼠粪便菌群主要包括4种菌属，分别是乳酸杆菌属（Lactobacillus）、大肠杆菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、毛螺菌科未分类菌属(Lachnospiraceae-unclassified)和Lachnospiraceae_NK4A136_group，占比高达50%以上。一般情况下，肠道内的大肠杆菌对人体无害的，只有当机体免疫力降低、肠道长期缺乏刺激等特殊情况下，大肠杆菌才会转变为致病菌，其中的血浆凝固酶能使含有肝素等抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质，是大肠杆菌主要致病物质。乳酸杆菌是能使糖类发酵产生乳酸的细菌。两者都是肠道多糖发酵的重要菌属之一。与BC组相比，HD、MD和LD组大肠杆菌-志贺菌属和乳酸杆菌属均显著增多。由此推测，灌胃给药大鼠肠道大肠杆菌-志贺菌属和乳酸杆菌属增多的原因主要是有两个方面：一是RCJ2-Ib作为良好的抗凝剂促使血浆凝固酶补偿性增多，导致大肠杆菌-志贺菌属一定程度迅速增长，此结果与第三章RCJ2-Ib具有良好的抗凝血活性相对应。二是随着大肠杆菌的增多，RCJ2-Ib作为一种乳酸菌发酵剂为维持肠道菌群的平衡，增加肠道乳酸菌数量和大肠杆菌数量。从图Fig.5a和图Fig.5b知，RCJ2-Ib灌胃给药各组毛螺菌科NK4A136组均明显降低，由此推测，LD、HD组可能会降低大鼠肠道和免疫系统的稳定性，但MD组对此无影响。
Fig.5 Phylogenetic tree of fungi (a) and heatmap at the genus level (b) for RCJ2-Ib
Conclusion
本研究采用水提醇沉法和柱色谱法从月季花中得到一种酸性多糖RCJ2-Ib，利用GC-MS，FT-IR以及NMR等技术手段得到RCJ2-Ib的部分结构为→4)-β-D-Manp-(1→连接的甘露聚糖醛酸。此外，RCJ2-Ib具有良好的体内抗凝血活性，发现其通过降低Hct、WBV、ESR和PV抑制血液的凝固；通过内源性凝血途径、外源性凝血途径以及降低血浆中纤维蛋白原的含量即凝血共同途径抑制血液的凝固，从而达到抗血栓的效果；通过降低ET-1和升高eNOS的含量来抑制血栓的形成；通过降低TXB2和升高6-Keto-PGF1α的含量以及维持6-Keto-PGF1α/TXB2的平衡来抑制血栓的形成，进而发挥良好的抗凝血活性。作为抗凝剂，RCJ2-Ib可以增加乳酸杆菌和大肠杆菌的数量，维持肠道菌群平衡。因此，RCJ2-Ib是一种有效维持肠道平衡的抗凝剂，在月季花的抗血栓活性中发挥重要作用。