罗布麻花多糖通过增强免疫应答、减少氧化应激、调节肠道菌群预防环磷酰胺诱导的免疫抑制
该成果以“Prevention of cyclophosphamide-induced immune suppression by polysaccharides from Apocynum venetum flowers via enhancing immune response, reducing oxidative stress, and regulating gut microbiota in mice”为题发表于中科院二区期刊Frontiers in Pharmacology杂志(IF5.6)。
罗布麻属于罗布麻科植物，中国是世界上最大的罗布麻分布区。罗布麻具有强效抗氧化、保肝、强心、降脂和抗凝血特性。我们前期研究发现罗布麻花多糖（AVFP）无毒，并从罗布麻花中分离得到两种多糖，即Vp2a-Ii和VP3。通过进一步的体外实验得出结论，Vp2a-Ii和VP3通过激活NF-κB/MAPK信号通路刺激细胞因子的表达，发挥免疫调节作用。但目前尚未见AVFP体内免疫研究的报道。
本课题组通过脏器指数、细胞因子水平、抗氧化应激能力、组织病理学变化、RNA-seq和16S rDNA技术探讨免疫抑制小鼠中AVFP的潜在机制。
结果与讨论
1. AVFP能够增加免疫抑制小鼠体重和脏器指数并调节血清细胞因子水平
我们每隔一天监测小鼠的体重。AVFP改善了 CTX 诱导的小鼠体重降低（图 1A）。补充AVFP后，AVFP-M和AVFP-L组的胸腺指数升高，AVFP-H组的脾脏指数显著升高（图1B、C）。在图1D-F中， 补充AVFP可降低TNF-α和ROS的水平，其中AVFP-H、AVFP-M和AVFP-L组的水平显著降低。然而，AVFP-L组的IL-2水平显着升高。这些研究结果表明，AVFP可以改善免疫抑制小鼠的体重降低，提高免疫器官的保护能力，改善血清细胞因子水平，增强机体的免疫能力。
图1. AVFP对小鼠体重 (A)、胸腺指数 (B)、脾脏指数 (C)、血清TNF-α (D)、血清ROS (E)、血清IL-2 (F) 的影响。
2. 罗布麻花多糖可降低免疫抑制小鼠血清中AST和ALT的活性并增强肝脏的抗氧化应激能力
通过检测小鼠的肝脏抗氧化应激能力和血清转氨酶活性发现，补充AVFP后，LEP、AVFP-H和AVFP-M组的AST活性显著降低，LEP和AVFP组ALT活性显著降低，尤其是补充AVFP组(图2A-B)。如图2C、D所示，CTX可显著降低GSH-Px和SOD的活性，增加MDA的含量，降低抗氧化应激的能力。然而，补充AVFP后，GSH-Px和SOD活性显著增加。如图2E所示，LEP和AVFP-L组的MDA含量极大降低。因此，AVFP可以降低AST和ALT活性，增强机体抗氧化应激的能力。
图2. AVFP对小鼠AST (A)、ALT (B)、GSH-Px (C)、SOD (D)、MDA (E)的影响。
3. 罗布麻花多糖可缓解免疫抑制小鼠脾脏组织的组织病理学变化
脾脏是重要的免疫器官，如图3所示，Control组小鼠脾脏形态正常，细胞排列整齐。 CTX诱导后，白髓面积变小，红髓比例减少较大，白髓与红髓分界不明显。补充AVFP后，AVFP-H组白髓病理恢复程度与LEP组相似，而AVFP-M和AVFP-L组无明显变化。我们的实验结果表明，AVFP可以减轻CTX引起的脾损伤，保护免疫器官，提高机体的免疫应激能力。
图3.AVFP对小鼠脾脏组织的影响。
4. 罗布麻花多糖对免疫抑制小鼠脾脏转录组的调控
转录组学可以比较研究样本之间的基因表达水平和变化，从而进一步探索疾病发生的机制。通过RNA-Seq平台总共检测了9个样本(图4)。Control和Mod组共鉴定出193个差异基因，Mod组和AVFP-M组共鉴定出99个差异基因。与Control组相比，Mod组有82个差异基因上调，111个差异基因下调。与Mod组相比，AVFP-M组28个差异基因上调，71个差异基因下调。最终筛选得到6个与免疫相关和抗氧化相关性较大的差异基因，即Bcl3、Hp、Lbp、Cebpd、Gstp2和Lcn2。Mod组和AVFP-M组之间的99个差异基因被注释为53个GO项，包括26个生物过程、17个细胞成分和10个分子功能，其中免疫系统过程、抗氧化活性和解毒与免疫相关(图5A)。 KEGG富集分析有助于进一步研究基因的生物学功能。其中前20条KEGG通路如图5B所示，横坐标是通过计算通路中差异基因的数量获得的，富集因子值越高，通路中差异基因的相对百分比越高。差异基因富集免疫相关信号信号通路为 NF-κB 信号通路。
图4. Mod与Control、AVFP-M与Mod组的差异基因火山图(A-B)和差异基因Venn (C)，Control、Mod和AVFP-M组中关键基因的表达水平 (D)。
图5.差异表达基因富集GO功能分析(A)和KEGG通路(B)。
5. 罗布麻花多糖对免疫抑制小鼠肠道菌群的调控
我们使用 16S rDNA 技术来评估 AVFP 对免疫抑制小鼠肠道微生物群的影响。在图6A中，LEP、AVFP-H和AVFP-L组的Chao1指数高于Mod组，表明AVFP可以提高CTX诱导的小鼠肠道微生物群的多样性。在图6B中，AVFP-H、AVFP-M、AVFP-L和LEP组的Shannon指数显著改善，表明AVFP可以提高小鼠肠道菌群的多样性。从图 6C、D 可以看出，AVFP 组的小鼠肠道微生物群分布与 CXT 诱导的小鼠显著不同，但与Control组相似，表明 AVFP 可以调节 CTX 诱导的小鼠肠道微生物的结构组成。
在门水平上（图6E），AVFP可以降低Bacteroidota的丰度，升高Firmicutes和Proteobacteria的丰度。在属水平上（图6F），CTX 增加的 Alloprevotella、Muribaculaceae、Parabacteroides、Lachnoclostridium、Prevotellaceae_Ga6A1_group 和 Lactobacillus 的趋势因补充AVFP而减少。同样，CTX 降低了 Lachnospiraceae_NK4A136_group、Roseburia、Lachnospiraceae_ UCG-001、Corynebacterium和 AVFP 的丰度，而AVFP 可以逆转这些变化。 LEfSe 分析验证了属水平的微生物丰度（图 6G）。
总的来说，CTX 诱导的肠道菌群失调可以通过补充AVFP得到恢复。同样，COG途径也用于评估肠道菌群的潜在功能。补充AVFP逆转了10条代谢途径，包括染色质结构和动力学、氨基酸转运和代谢、核苷酸转运和代谢、辅酶转运和代谢、转录、细胞壁/膜/包膜、细胞运动以及次生代谢物的生物合成、运输和分解代谢（图7A）。结果表明，AVFP可以通过调节肠道微生物的代谢功能来增强机体的免疫力。在图7B-D中，CTX可以明显降低盲肠内容物中乙酸和丁酸的水平，但对丙酸水平没有明显的影响。补充AVFP后，AVFP-H和AVFP-M组的乙酸和丁酸水平升高，但AVFP-L组的丁酸水平没有明显变化。然而，AVFP对丙酸水平也没有明显的影响。这表明AVFP可以通过提高乙酸和丁酸的水平来调节肠道菌群，增强免疫力。
图6. AVFP对小鼠α-多样性(A-B)和β-多样性(C-D)的影响；门、属优势群相对丰度的影响(F)；(G)Lefse分析。
图6. COG功能丰度分布；(A) AVFP对小鼠盲肠SCFAs的影响(B-D)。
综上所述，AVFP可以保护CTX诱导小鼠的免疫器官，调节血清细胞因子水平，增强肝脏的抗氧化应激能力，降低血液中转氨酶的活性，这表明AVFP可以显著增强免疫力，提高机体的抗氧化应激能力。此外，转录组学结果表明，AVFP可提高免疫相关基因Bcl3、Hp、Lbp、Cebpd和Lcn2以及抗氧化相关基因Gstp2的表达，并参与NF-κB信号通路、免疫系统过程、抗氧化活性和排毒等过程。同时，AVFP可以增加有益菌群的丰度，提高细菌的比例，增加肠道SCFAs的含量，有利于肠道环境的稳定状态。我们的实验数据表明，AVFP在体内具有潜在的免疫调节作用和抗氧化作用，为进一步的研究提供了理论基础。