该成果以“Rapid identification of α-glucosidase inhibitors from Poria by spectrum-effect, component knock-out and molecular docking technique”为题发表于中科院Top二区《Frontiers in Nutrition》杂志（IF: 5.0）。
Introduction
研究表明，茯苓与降血糖活性有着密切的关系，实验室前期预实验表明茯苓能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性。但茯苓成分复杂，抑制α-葡萄糖苷酶的活性化合物并不明确。为了加强茯苓在降血糖领域的利用，需要进一步明确其中的活性化合物。谱效关系研究是目前快速确定中药中对应功效成分的方法，在研究中有较多应用。谱效关系研究通常包含两个步骤，首先通过分析方法建立含有化学成分信息的色谱指纹图谱，同时利用体外或体内的试验模型来获取“效”信息。然后通过化学计量学方法对上述实验数据进行分析和整合，揭示化学成分与功效之间的关系，进而识别关键的有效物质。
本研究以不同产地的茯苓为研究对象，建立茯苓中化学成分与α-葡萄糖苷酶抑制活性的谱效关系；以期为茯苓质量标准与控制的理论及实践提供研究依据。并且利用特异性成分敲出技术辨识茯苓抑制α-葡萄糖苷酶活性组分，确定活性功效成分。
Fig. 1 Sketch diagram of Spectrum-effect relationship analysis
Results and Discussion
茯苓的指纹图谱
记录茯苓提取物在2个检测波长下的HPLC图谱(Fig. 2)。
Fig. 2 HPLC chromatogram of a Poria extract
将各批次茯苓的HPLC图谱导入《中药色谱指纹相似度评价系统(2012年版)》软件，对Fig. 3中两个检测波长的23个共同峰进行匹配。
(a)
(b)
Fig. 3 HPLC feature peak matching map of 12 batches of Poria (a. the fingerprint of Poria detected at 242 nm; b. the fingerprint of Poria detected at 210 nm)
由Fig.3a可知，在242 nm检测波长处共有18个共峰，P9、P15、P12、P13的检测信号较高。在Fig.3b中，根据相应的保留时间，在210 nm波长处鉴定出5个新的共有峰，其中P22、P20、P21、P19的检测信号较强。基于两种波长检测系统，从茯苓指纹图谱中共鉴定出23个共同峰。
茯苓提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性
不同批次茯苓提取物的体外α-葡萄糖苷酶抑制率见Table 3。结果表明，当浓度为1 g/mL（相当于茯苓原料药）时，大部分样品的抑菌率在13.65 - 81.71%之间。随着茯苓浓度的降低，相应的抑制率变弱。总的来说，12批茯苓样品对α-葡萄糖苷酶的抑制程度差异较大。
Table 3 Inhibitory rate of α-glucosidase from 12 batches of Poria extracts (x±s, n=3)
基于PLSR的谱-效分析
以12批茯苓样品的α-葡萄糖苷酶抑制率数据和量化特征图谱色谱峰信息所作的偏最小二乘回归方程的回归系数如Fig. 4所示。结果表明，P2、P4、P7、P8、P10、P13、P16、P17、P20、P22和P23与抑制α-葡萄糖苷酶的能力呈正相关，而P1、P3、P5、P9、P11、P12、P14、P15、P18、P19和P21与抑制α-葡萄糖苷酶的能力呈负相关，说明增加具有正抑制作用的化合物的比例可以增强茯苓对α-葡萄糖苷酶的抑制能力。
Fig. 4 PLSR coefficient diagram of Poria
为了进一步确认其潜在的抑制活性，我们将目标化合物P1、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14、P15、P21、P22、P23以及相应的阴性样品进行α-葡萄糖苷酶的抑制作用测试。结果如Fig. 5所示。
总的来说，所有化合物和阴性溶液对α-葡萄糖苷酶都有一定的抑制作用。其中，P1、P5、P6、P7、P9、P12、P14、P15、P21、P22、P23对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，P8、P10、P13对α-葡萄糖苷酶的抑制作用较弱。可见，对于大多数化合物来说，分离是改变其对α-葡萄糖苷酶抑制作用的有效途径之一。
Fig. 5 Analysis of antagonistic and synergistic effects between knock-out compounds of Poria extract and negative samples.
目标成分的鉴定
在2.2.6的质谱条件下，用正离子模式检测目标成分的相对分子质量。然后，利用正离子模式和相关文献，推断出化合物的可能分子结构。最终鉴定出茯苓中敲出的P8、P9、P10、P12、P13、P14、P21和P22 共8个化合物。P8的UPLC-MS2结果(保留时间为12.08094 min)如Fig. 6所示，在正离子模式下产生一次离子峰m/z 485.0189[m+H]+，由此推测化合物的分子量为484，可能的分子式为C30H44O5。该化合物的裂解途径如Fig. 6b所示，表明该化合物为茯苓酸B。
(a)
(b)
Fig. 6 Mass spectra results of P8 of Poria (a. Positive ion mode; b. the proposed fragmentation pathway of poricoic acid B)
同理，P9、P10、P12、P13、P14、P21、P22分别推定为去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、3β-乙酰氧基-16α-羟基-羊毛甾-8,24-二烯酸、茯苓酸。具体列于Table 4。
Table 4 Identification of chemical compounds in Poria
目标成分与α-葡萄糖苷酶的分子对接
本研究采用分子对接技术，模拟了P8、P9、P10、P12、P13、P14、P21、P22与α-葡萄糖苷酶的结合位点和结合力作用，结果如Fig. 7所示。
Fig. 7 Molecular docking interaction of target compounds (a & b. poricoic acid B (P8); c & d. dehydrotumulosic acid (P9); e & f. poricoic acid A (P10); g & h polyporenic acid C (P12); i & j. 3-epidehydrotumulosic acid (P13); k & l. dehydropachymic acid (P14); m & n. 3-O-Acetyl-16α-hydroxytrametenolic acid (P21); o & p. pachymic acid (P22))
可以看出，这些化合物与α-葡萄糖苷酶的相互作用主要是通过烷基和pi-烷基与甲基和C-17侧链、a环、b环或c环的双键，其次是与C-3和C-16的羟基、羧基或乙酰氧基形成常规氢键。此外，这些化合物有时也可以直接与α-葡萄糖苷酶环结合。
为明确相互作用关系，将化合物与α-葡萄糖苷酶的相互作用关系收集于Table 5。综上所述，α-葡萄糖苷酶主要与苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)、精氨酸(ARG)、缬氨酸(VAL)、组氨酸(HIS)等通过烷基氢键和常规氢键相互作用，这可能是茯苓抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用机制。
Table 5 The interaction site of α-glucosidase with active compounds
Conclusion
本研究采用高效液相色谱法对茯苓进行指纹图谱分析，鉴定出23个共有峰。利用谱效关系分析和PLSR分析预测茯苓中23个化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。结合“成分敲出”技术、LC-MS2和分子对接技术，敲出了14个常见化合物，鉴定了8个活性化合物的分子结构供进一步分析。通过分析得出，茯苓酸B、去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、3β-乙酰氧基-16α-羟基-羊毛甾-8,24-二烯酸和茯苓酸对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用，其抑制作用可能与主要通过烷基和氢键与α-葡萄糖苷酶相互作用有关。这些结果对茯苓的质量控制和开发治疗糖尿病的有效药物具有重要意义。