Introduction
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）定植于上呼吸道，对抗生素具有耐药性。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是医院和社区环境中常见的获得性感染源，如引起肺炎。由于多耐药金黄色葡萄球菌的出现，寻找预防或治疗感染的替代药物具有重要意义。
清消五味汤（QXWWD，QingXiaoWuWei decoction）是一种具有抗炎、抗菌作用的有效临床方剂。由苦参、艾叶、蛇床子、大黄和冰片组成。既往及近期研究表明，QXWWD可显著缓解MRSA所致肺炎小鼠肺部感染，降低促炎细胞因子及趋化因子水平，从而减轻肺损伤。这可能主要是通过其对肠道微生物群及其代谢物SCFAs的积极影响来实现的。本研究旨在探讨QXWWD治疗MRSA诱导的肺炎的药理机制。我们的研究结果表明，QXWWD治疗增加了微生物来源的SCFAs，这促进了小鼠模型的肠道健康。此外，非靶向代谢组学分析进一步表明，QXWWD显著调节代谢重构，特别是通过增强柠檬酸循环（TCA循环）。在QXWWD处理后，转录组分析显示与巨噬细胞抗菌和免疫活性相关基因的发生差异表达。这些发现阐述了QXWWD治疗减轻MRSA诱导的肺炎相关病理的机制，指出QXWWD在治疗难治性细菌性肺炎方面具有潜在的治疗作用。
Main body
QXWWD的高分辨率质谱分析
结果通过对QXWWD供试品溶液进样分析，获得正、负离子模式总离子流图如图1所示，以质量偏差不超过10×10-6为标准结合二级质谱裂解碎片信息及相关文献信息，对QXWWD的化学成分进行表征解析，结果在QXWWD中共鉴定出62个化学成分，包括30个黄酮类成分、9个生物碱类成分、8个蒽醌类成分、4个香豆素类成分、4个有机酸类成分、2个氨基酸类类成分、2个萜类成分以及苯酚、萜烯和二苯乙烯类成分各1个。
图1 清消五味汤成分分析总离子流图
基于高分辨率质谱的网络药理学
对获得的62个成分进行网络药理学分析。结果获得813个疾病靶点，获得834成分靶点，绘制韦恩图得到了126个核心靶点（图2A）。将这些核心靶点导入Cytoscape 3.8.0中，获得化合物-靶点网络（图2B）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（图2C）。使用David数据库对126个共同靶点进行GO功能富集分析。共获得656个条目，包括炎症反应和细胞因子介导的信号通路（图2D）。随后进行KEGG（京都基因与基因组百科全书）功能富集分析，Th17细胞分化、HIF-1、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-17（IL-17）以及C型凝集素受体信号通路都是与微生物感染免疫应答相关重要通路（图2E）。因此，基于高分辨率质谱的网络药理学研究结果表明，QXWWD在病原体入侵的免疫应答中起重要调节作用。
图2 清消五味汤中62个成分的网络药理学分析结果
QXWWD显著减轻MRSA诱导的小鼠肺炎
为了证实QXWWD对小鼠MRSA肺炎是否有改善作用。课题组采用滴鼻法构建MRSA肺炎小鼠模型，以3 mg/kg的万古霉素作为阳性对照，评价不同剂量的清消五味汤对小鼠MRSA肺炎相关表型的改善作用，实验设计如图3A所示。结果显示，清消五味汤对各组小鼠体重增长无明显影响（图3B），QXWWD可显著降低肺组织湿干比，支气管肺泡灌洗液炎性因子TNF-α、IL-6、1L-1β和趋化因子MCP-1、CXCL-1水平（图3C），并可降低96 h内MRSA肺炎小鼠死亡率（图E）以及肺组织匀浆菌落计数（图3D）。纵向比较来看，清消五味汤中剂量（402 mg/kg）和低剂量（201 mg/kg）的药效在某些指标中体现并不明显，但高剂量（804 mg/kg）的治疗效果较为显著。
图3 清消五味汤药效学评价结果
H&E染色根据每张切片的管腔周围浸润的程度、血管周围浸润的程度、肺泡壁增厚程度将对照组、MRSA肺炎模型组、清消五味汤高、中、低剂量组和阳性药物组进行组织病理学检查及评分，分数越高提示肺组织的炎症浸润程度越高。如图4A所示，MRSA肺炎模型组肺脏组织可见大面积肺泡壁轻度增厚（黑色箭头），细支气管及血管周围伴有大量的淋巴细胞浸润（蓝色箭头），给予不同剂量组清消五味汤干预后，肺脏组织偶见血管周围伴有少量淋巴细胞（蓝色箭头），各级支气管形态完整，肺泡腔未见明显异常；肺泡巨噬细胞Marker F4/80免疫组化（图4B）采用Aipathwell软件将对照组、MRSA肺炎模型组、清消五味汤高、中、低剂量组和阳性药物组进行组织阳性细胞比率计算及H-Score评分（图4D）。综合体内药效和组织病理学结果，表明清消五味汤可显著改善小鼠MRSA肺炎相关表型。而免疫荧光结果(图4C)显示，MRSA感染后促炎型M1巨噬细胞中Marker iNOS的产生也增加。此外，我们还观察到QXWWD治疗后抗炎型M2巨噬细胞中Marker CD206表达上调，以上结果提示QXWWD可能通过介导巨噬细胞极化而发挥抗炎功能。
图4 组织病理学
QXWWD在肠道微生物群衍生的SCFA代谢产物中的作用
为了探讨肺炎症状缓解与肠道菌群是否有关系，我们对各组小鼠粪便样本中的16S rRNA进行了测序。主坐标分析表明，MRSA感染促进了肠道微生物群的失调。此外，QXWWD缓解了MRSA诱导的生态失调，因为主成分分析图显示高剂量组和中剂量组的微生物群和对照组中比阳性和低剂量组更紧密地和对照组聚集。此外，我们采用β-多样性分析(图5B)评估了物种在组内和组间的多样性。蓝色显示表示样本接近和显著相似，红色显示样本之间的差异较大，相似程度较低。采用Chao 1、Simpson和Shannon指数进行α-多样性分析(图5C)，表明 QXWWD不影响动物的菌群多样性。我们又对肠道菌群组成按门水平进行了评估。结果表明，MRSA感染增加了变形菌门的丰度，这是肠道菌群失调的标志。而QXWWD (804 mg/kg)可显著提高了MRSA诱导的Bacteroidetes相对丰度的降低，如图5E所示。此外，我们构建了基于线性判别分析评分的直方图。如图5F所示，QXWWD治疗后，一些与短链脂肪酸产生相关的菌株显著富集，这些数据表明，QXWWD可以防止肠道菌群失调和MRSA引起的肺炎。此外，这些益处可能依赖于一些短链脂肪酸产生菌的富集。
图5 小鼠粪便样本的16S rRNA测序分析
QXWWD在肠道微生物群衍生的SCFA代谢产物中的作用
为了确认改变的肠道微生物群组成是否增加了SCFAs水平，我们通过高分辨率液相色谱-质谱法在对照组、MRSA诱导的肺炎模型和QXWWD (804 mg/kg)治疗组的小鼠血清进行了靶向SCFAs代谢组学检测（图6A）。与模型组相比，QXWWD治疗后显著提高了乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸和己酸水平和总短链脂肪酸的含量，但对戊酸、异戊酸无影响（图6B）。
图6 血清短链脂肪酸（SCFAs）的测定
QXWWD通过肠道微生物和SCFAs缓解MRSA诱导的肺炎
为了更加确切的证明QXWWD是否通过肠道菌群-SCFAs轴缓解小鼠MRSA肺炎。我们进行了粪菌移植实验，具体实验流程如下：在供体小鼠服用QXWWD或生理盐水后14天后收集粪便样本。将供体鼠粪便在无菌PBS中制成0.125 g/mL的匀浆，然后离心。受体小鼠口服灌胃给予抗生素7天以耗竭肠道菌群。将供体鼠的粪便上清每天灌胃给受体小鼠，持续7天，之后进行MRSA感染。24 h后，小鼠分别灌胃无菌生理盐水或SCFA混合物，灌胃7 d（图7A）。粪菌移植实验结果显示：未经灌胃QXWWD治疗组粪便或灌胃SCFAs的受体鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的TNF-α、IL-6、IL-1β、CXCl-1、MCP-1水平和W/D比更高(图7B)。而QXWWD粪便受体鼠和SCFAs治疗组显示出较低的BALF TNF-α、IL-6、IL-1β、CXCl-1、MCP-1水平和W/D比的趋势(图7B)。此外，通过组织学分析， MRSA诱导的肺炎受体鼠的组织学评分高于QXWWD粪便受体鼠和SCFAs治疗组(图7D)。这些结果表明，QXWWD通过肠道微生物群-SCFAs轴减轻小鼠MRSA诱导的肺炎。
图7 粪菌移植和短链脂肪酸干预实验结果
QXWWD调节MRSA诱导的小鼠肺炎的代谢重构
随后使用血清非靶向代谢组学分析来评估QXWWD治疗后的代谢变化。具体实验流程如（图8A）。PCA和200次置换检验表明分析模型有效（图8B、C），根据P < 0.05和VIP值> 1在对照和模型组中筛选出193种差异代谢产物，在模型和给药组中筛选出180种差异代谢产物（图8E）。对模型和给药组中筛选出180种差异代谢物进行KEGG通路富集分析显示，在QXWWD给药后，直接参与短链脂肪酸代谢的TCA循环显著增强图（8F、G）。对对模型和给药组中筛选出180种差异代谢物进行KEGG通路富集分析显示（图8F），亚油酸代谢、TCA循环和氨基酸代谢等几种营养和能量代谢关联的代谢途径显著富集。研究发现，在QXWWD处理下，直接参与短链脂肪酸(即乙酸、丙酸和丁酸)代谢的TCA循环(图8G)显著增强。在厌氧条件下，乙酸盐和丁酸盐主要通过乙酰辅酶a产生，而丙酸盐则由丙酮酸酯或磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)通过多种途径产生。在有氧条件下，过量的碳水化合物通过磷酸酶/乙酰激酶A (Pta/AckA)途径通过乙酰辅酶A被消化成醋酸盐。免疫细胞可以识别细菌产生的丙酸、丁酸和醋酸盐。
图8 血清非靶向代谢组学分析
QXWWD改变基因表达谱并激活巨噬细胞调节网络
为了进一步解释QXWWD改善小鼠MRSA肺炎的机制，我们从小鼠肺泡灌洗液中分离小鼠原代肺泡巨噬细胞，并对原代肺泡巨噬细胞进行了转录谱测序(图9A)。PCA结果显示（图9B），对照组、MRSA肺炎模型和QXWWD (804 mg/kg)治疗组中基因的表达水平具有统计学差异。经统计分析（ P < 0.05 and |LogFC| > 1），在对照组和模型组中筛选出56个差异基因，在模型组和QXWWD治疗组中筛选出25个差异表达基因（图9D）。对模型组和QXWWD治疗组的前20个显著改变的差异基因绘制基因表达网络（图9E），包括7个上调基因(Per2、Dbp、Ciart、Zbtb16、Plxna2、Map3k6、kcn1)和13个下调基因(Npas2、Arntl、CYP1a1、Cxcl5、Crabp2、Acan、Ucp1、Spon2、Ereg、NLRP12、Krt6a、Fam124b、Col10a1)。经过查阅文献和前期实验，我们锁定了两个基因NLRP12和CYP1A1可能与巨噬细胞的杀菌和吞噬功能相关的基因。随后，我们通过与肺组织巨噬细胞Marker F4/80免疫荧光双染色证实（图9F、G），NLRP12和CYP1A1表达水平在模型组中上调，在QXWWD治疗组中显著下调。差异基因的KEGG(图9H)通路分析显示，与免疫、感染、营养和能量代谢密切相关的一系列信号通路显著富集。
图9 肺泡巨噬细胞转录组学分析
Conclusion
本研究结合多种组学技术，如基于质谱的网络药理学、16S rRNA测序、靶向血清SCFA代谢组学、粪菌移植、非靶向代谢组学和巨噬细胞转录组测序，揭示了清消五味汤通过“肠道菌群-短链脂肪酸轴”调控代谢重构和巨噬细胞基因表达网络改善耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所致小鼠肺炎。此外，这项研究有助于阐明QXWWD在改善耐药细菌性致肺炎方面的潜在治疗潜力。
第一作者
李君，助理研究员，国家自然科学基金项目评审专家，中国药理学会会员，内蒙古药理学会副秘书长、常务理事，内蒙古营养学会会员，Food & Medicine Homology杂志青年编委、南方医科大学学报青年编委。主要致力于中蒙药质量评价、药效物质基础、中蒙药抗炎与免疫药理研究，在疾病分子机制方面特别关注于药物通过调控代谢、肠道菌群介导的信号通路与疾病之间的关系。目前，主持国家自然科学基金项目1项，教育部产学研协同育人项目1项，内蒙古自然科学基金1项，教育厅项目1项，卫健委项目1项，主持校级项目4项，作为主要成员参与国家自然科学基金3项，以第一作者或通讯作者发表论文20余篇，SCI 4篇，参与编写蒙药专著1部，授权实用新型专利1项，授权发明专利1项。指导学生项目10余项，获第十届全国大学生基础医学创新研究暨实验设计论坛获中医药学赛道复赛三等奖。
张谦，副研究员，国家自然科学基金评审专家，《Journal of Future Foods》、《Traditional Medicine Research》、《Integrative Medicine Discovery》、《Food & Medicine Homology》、《Pharmacology Discovery》、《Infectious Diseases Research》《南方医科大学学报》青年编委，内蒙古药理学会常务理事。主要从事中药抗炎与免疫药理研究，在疾病分子机制方面特别关注于药物通过调控肠道菌群、生理活性脂质及脂代谢介导的信号通路与疾病之间的关系。目前主持国家自然科学基金1项、主持内蒙古自然科学基金1项，主持教育厅项目2项，主持卫计委项目1项，主持校级项目5项。参与国家自然科学基金5项；发表SCI收录论文7篇，第一作者及共同第一作者5篇，发表中文期刊论文20余篇，其中第一作者和通讯作者13篇；主编专著1部，参编专著1部，获批国家实用新型专利2项；获得2024年《Traditional Medicine Research》杂志优秀青年编委，优秀审稿人，获得2023年内蒙古医科大学创新人才奖。指导学生项目10余项，在内蒙古自治区第十三届“挑战杯” 全区大学生课外学术科技作品竞赛获自治区一等奖2项，在第十三届“挑战杯”全区大中学生创业计划竞赛获自治区二等奖1项，在第九届中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛内蒙古赛区获得铜奖1项，在第八届全国大学生基础医学创新研究暨实验设计论坛获中医赛道优秀奖。
通讯作者
马宇衡，教授，硕士研究生导师，主持及参与国家自然科学基金、“十二五科技重大专项课题”（子项目）、内蒙古自治区自然科学基金、科技引导项目以及人才基金等各级科研项目近20项。发表学术论文20余篇，出版专著1部，申请专利5项。取得自治区“草原英才”称号、“321人才工程”。曾获得内蒙古自治区“中国梦劳动美”青年教师课堂技艺大赛二等奖；“钟山杯”全国药学专业微课大赛一等奖。主要从事新药研究开发，在工作中利用现代化药物研发手段，对特色蒙药材进行深入研究，针对抗肿瘤靶点和糖尿病靶点进行药物开发。在新药开发过程中建立了内蒙古医科大学化学生物学及仿生药物合成与开发研究平台，并建立了计算机辅助药物设计平台，推进蒙药现代化进程。
王焕芸，教授，硕士生导师，内蒙古医科大学药学院院长。近年来，主持及参与国家级项目3项、自治区级项目16项、校级项目4项。发表论文50余篇。编写教材4部。授权发明专利1项、实用新型专利15项。主要从事药物分析及中蒙药药效物质基础方向的教学与科研工作。任《内蒙古医科大学学报》编辑委员会，常务编委，内蒙古自治区图书馆学会，副理事长，内蒙古蒙中药产业技术创新战略联盟专家委员会，委员，内蒙古医科大学教学督导委员会，委员。