Introduction
倍半萜内酯（SLs）因其多样的生物活性和结构多样性，成为新药和治疗剂发现的热门领域。SLs的独特结构使其具有多种生物活性，包括抗炎、抗癌、抗疟疾和免疫调节活性，涉及核因子κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）和NLR家族含pyrin结构域3（NLRP3）等通路。SLs还被报道可以调节核因子E2相关因子2/kelch样ECH相关蛋白1（Nrf-2/Keap-1）通路，作为细胞防御氧化损伤的关键机制。基于AI算法的MS鉴定和去重复策略的应用，显著改变了天然产物的发现过程。FBMN在代谢组学中越来越受欢迎，能够区分异构体，并促进了光谱注释和相对定量信息的获取。SLs在MS/MS碎片模式中表现出连续的H2O和CO中性丢失，形成特征离子峰，这为使用FBMN策略进行结构鉴定和注释提供了特殊优势。
天山雪莲（S. involucrata）生长在中亚的高山地区，是菊科的一种多年生草本植物，因其耐寒性和独特的生长条件而备受重视。长期以来，它被视为重要的植物性膳食补充剂和宝贵的中药材。不同地方药物在治疗妇科疾病、缓解呼吸道症状和止痛方面的临床应用具有相似性。初步文献综述显示，天山雪莲含有多种高含量的SLs，已从其地上部分分离出约30种倍半萜类化合物。为了探索和评估天山雪莲中的生物活性SLs，中国科学院昆明植物研究所张于研究员等从其地上部分分离并鉴定了15种SLs，其中包括11种新化合物sauruintones A-K（1–8和13–15）。通过质谱、光谱方法、计算化学和单晶X射线衍射对其结构进行了表征。利用基于特征的分子网络（FBMN）策略对SLs的MS/MS碎片模式进行了注释。大多数SLs通过增强抗氧化酶（CAT）水平和降低丙二醛（MDA）水平来发挥其抗氧化应激的保护作用。其中，化合物12表现出显著的活性氧（ROS）抑制活性，并在10–25 μM浓度下增强了CAT、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）的活性，同时降低了MDA的含量。进一步的RT-qPCR实验和Western blot分析表明，它通过激活核因子E2相关因子2（Nrf-2）信号通路来降低ROS水平。
Results and Discussion
2.1 FBMN 注释
基于质谱的分子网络技术极大地加速了生物活性和新型天然产物的发现过程。通过HPLC-Q-TOF-MS/MS对S. involucrata乙酸乙酯部分的E52组分进行了分析，随后进行了分子网络可视化。如图2所示，分子网络共包含261个质谱节点，其中包括6个簇（节点数≥2）和197个单节点。研究表明，倍半萜内酯（SLs）在MS/MS检测中容易发生H2O和CO的中性丢失。簇1中的大多数质谱节点符合这一特征，主要由SLs组成。天山雪莲中的倍半萜主要为愈创木内酯类，其特征是在C-6位形成带有羟基的五元内酯环，并在C-12位带有羧基，同时伴随着骨架结构中的碳丢失或氧化。为了全面鉴定和注释簇1中的化合物，总结了天山雪莲中两类SLs的MS/MS裂解规律和特征碎片离子（图S98）。I型和II型SLs均表现出连续的H2O丢失、CO中性丢失以及C4H4片段的丢失，从而在MS/MS谱中形成不同的特征离子峰。I型SLs通常在中性丢失H2O和CO片段后形成C15H21O2+、C15H19O2+、C14H19+和C14H17+的特征离子峰。而II型SLs除了上述片段丢失外，由于骨架结构的氧化，还会形成带有额外氧的特征离子峰，包括C14H17O3+、C14H15O3+、C13H17O+和C13H15O+。这些中性丢失和特征碎片离子为基于FBMN的注释提供了SLs结构特征的指示。因此，簇1中的主要质谱节点基于两种MS/MS碎片模式进行了注释。共注释了16个属于SLs的质谱节点，包括4个新节点和12个已知节点，这为我们后续的定向分离提供了重要指导。此外，为了验证我们的MS/MS碎片推断，使用化合物3和12研究了MS/MS碎片行为，并阐明了两种类型SLs的基本特征。它们的MS/MS碎片完全分配，并与推断的两种MS碎片模式一致（图S99-102）。
图 1. 1-15 的结构从 S. involucrata 的地上部分分离出来
图 2. 基于 FBMN 策略的 SLs 的分子簇和注释节点
2.2 分离化合物的结构解析
化合物1为无色无定形粉末，分子式为C15H18O3。通过HR-ESI-MS（m/z 247.1326 [M + H]+）推断其分子式。IR光谱显示存在α,β-饱和γ-内酯基团（1744 cm-1）。1H NMR数据显示六个烯烃质子和一个氧代次甲基质子。13C NMR光谱显示15个碳共振信号，具有愈创木内酯型倍半萜的特征信号。通过HMBC光谱分析，确定了羟基在C-1位置的位置。
图 3. 选定的 HMBC（箭头）和1H–1化合物 1-8 和 13-15 的 H COSY 相关性（粗线)
通过ROESY光谱分析，确定了H-5和H-7的α取向，H-6为β取向。通过GIAO计算方法进行13C NMR计算，确定了1的相对构型为(15*,58*,68*,75*)-1，并通过ECD光谱确定了其绝对构型为15,58,65,75。化合物1的结构被鉴定并命名为sauruintone A。
图 4. 化合物 1-8 和 13-15 的选定 ROESY 相关性
图 5. 1、3、6 和 13 的实验和计算的 ECD 频谱
化合物2为无色晶体，分子式为C15H20O3。通过HR-ESI-MS（m/z 249.1483 [M + H]+）推断其分子式。1H NMR光谱显示一个甲基、四个烯烃质子和一个氧代次甲基质子。13C NMR光谱显示15个碳信号，包括一个甲基、六个亚甲基、四个次甲基和四个季碳。通过HMBC光谱分析，确定了甲基在C-11位置的位置。通过ROESY光谱分析，确定了H-1/H-5/H-7/H-13的α取向，H-6为β取向。通过ECD光谱确定了其绝对构型为(1R,55,68,77,118)-2。化合物2的结构被鉴定并命名为sauruintone B。
化合物3为白色无定形粉末，分子式为C14H18O3。通过HR-ESI-MS（m/z 257.1145 [M + Na]+）推断其分子式。13C NMR光谱显示14个碳共振信号，具有愈创木内酯型倍半萜的特征信号。通过HMBC光谱分析，确定了酮羰基在C-4位置的位置。通过ROESY光谱分析，确定了H-5/H-7的α取向，H-6为β取向。通过ECD光谱确定了其绝对构型为(1R,55,68,75,118)-3。化合物3的结构被鉴定并命名为sauruintone C。
化合物4和5为白色无定形粉末混合物，分子式分别为C14H16O3和C14H18O3。通过HR-ESI-MS（m/z 233.1169 [M + H]+和m/z 235.1328 [M + H]+）推断其分子式。通过HMBC光谱分析，确定了酮羰基在C-10位置的位置。通过ROESY光谱分析，确定了H-1/H-9a和H-5/H-7的α取向，H-6为β取向。化合物4和5的结构被鉴定并命名为sauruintone D和E。
化合物6为无色油状物质，分子式为C19H24O4。通过HR-ESI-MS（m/z 339.1564 [M + Na]+）推断其分子式。通过HMBC光谱分析，确定了异丁酰基在C-8位置的位置。通过ROESY光谱分析，确定了H-1/H-5/H-7的α取向，H-6和H-8为β取向。通过ECD光谱确定了其绝对构型为(1R,5R,6R,7R,8S)-6。化合物6的结构被鉴定并命名为sauruintone F。
化合物7为无色针状晶体，分子式为C24H32O9。通过HR-ESI-MS（m/z 465.2114 [M + H]+）推断其分子式。通过HMBC光谱分析，确定了糖单元和侧链在C-8和C-6'位置的位置。通过ROESY光谱分析，确定了H-5/H-7的α取向，H-6/H-8/H-11为β取向。通过X射线衍射实验确定了其绝对构型为(R,5R,6R,7R,8S,11S,1'S,2'S,3'R,4'R,5'S)-7。化合物7的结构被鉴定并命名为sauruintone G。
图 6. 化合物 7 和 15 的 X 射线 ORTEP 图
化合物8为无色油状物质，分子式为C20H28O10。通过HR-ESI-MS（m/z 581.2361 [M + Na]+）推断其分子式。通过HMBC光谱分析，确定了糖单元和取代基在C-8和C-6'位置的位置。化合物8的结构被鉴定并命名为sauruintone H。
化合物13为白色无定形粉末，分子式为C14H16O3。通过HR-ESI-MS（m/z 255.0987 [M + Na]+）推断其分子式。通过HMBC光谱分析，确定了酮羰基在C-5位置的位置。通过ROESY光谱分析，确定了H-1/H-7的β取向，H-6为α取向。通过ECD光谱确定了其绝对构型为1R,6R,7S。化合物13的结构被鉴定并命名为sauruintone I。
化合物14为无色油状物质，分子式为C21H32O7。通过HR-ESI-MS（m/z 419.2042 [M + Na]+）推断其分子式。通过HMBC光谱分析，确定了糖单元在C-12位置的位置。通过ROESY光谱分析，确定了H-5/H-7的α取向，H-14为β取向。化合物14的结构被鉴定并命名为sauruintone J。
化合物15为无色针状晶体，分子式为C20H27NO5。通过HR-ESI-MS（m/z 362.1969 [M + H]+）推断其分子式。通过HMBC光谱分析，确定了羟基在C-8位置的位置。通过ROESY光谱分析，确定了H-5/H-7的α取向，H-6/H-8/H-11为β取向。通过X射线衍射实验确定了其绝对构型为(1R,5R,6R,7R,8S,11R,2'R)-15。化合物15的结构被鉴定并命名为sauruintone K。
2.3 化合物在H2O2诱导的HepG2细胞中通过CAT和MDA水平评估的抗氧化活性
抗氧化防御对于保护细胞免受自由基诱导的氧化应激、炎症和组织损伤至关重要。CAT和MDA是评估细胞抗氧化状态的核心指标，CAT代表对抗ROS的第一道防线，MDA则指示氧化应激水平。通过测定H2O2诱导的HepG2细胞模型中的CAT和MDA水平，评估了天山雪莲中SLs及其苷类的抗氧化活性。化合物2和3在12.5 μM浓度下显著提高了CAT水平，并在25–50 μM和12.5–25 μM浓度下降低了MDA含量。化合物7在12.5–50 μM浓度下显著增强了CAT水平，但对MDA含量没有显著影响。化合物9和13在12.5–50 μM浓度下显著降低了MDA含量。化合物2、8和11在25–50 μM浓度下显著抑制了MDA的产生，而化合物3和10在12.5–25 μM浓度下表现出中等程度的抑制作用。这些结果表明，α,β-饱和γ-内酯基团对SLs的抗氧化活性至关重要，并且SLs具有显著的抗氧化特性。
图 7. 化合物对 50、25 和 12.5 μM 抗氧化酶 CAT 活性的影响。“H2O2−，化合物 −“表示对照组;“ H2O2+，复合词 −“ 代表 H2O2−诱导模型组，其中 50、25 和 12.5 的值代表化合物的不同浓度处理组。结果来自三次运行中的代表性实验，显示出相似的模式。与对照组 （P< 0.001） 和模型组 （P < 0.01，P < 0.001） 相比差异 显著。###*****
图 8. 化合物对 50、25 和 12.5 μM 时 MDA 水平的影响。“H2O2−，化合物 −“表示对照组;“ H2O2+，复合词 −“ 代表 H2O2−诱导模型组，其中值 50、25 和 12.5 代表化合物的不同浓度处理组。结果来自三次运行中的代表性实验，显示出相似的模式。与对照组 （P< 0.001） 和模型组 （P < 0.01，P< 0.001） 相比差异显著。###*****
考虑到化合物12在天山雪莲中的高含量（产量331 mg/kg）及其在初步酶测定中的强效抗氧化活性，我们选择其进行进一步评估。化合物12在10–50 μM浓度下对HepG2细胞没有细胞毒性。进一步测定抗氧化酶（CAT、SOD和GSH）和MDA水平的结果显示，化合物12在6.25–25 μM浓度下显著逆转了H2O2诱导的HepG2细胞中CAT和GSH的下调。此外，它在25和12.5 μM浓度下显著逆转了SOD的下调和MDA的上调。结果表明，化合物12通过增强抗氧化酶CAT、SOD和GSH的活性，同时降低MDA水平，改善了HepG2细胞的氧化应激并防止了细胞损伤。
图 9. 化合物 12 对细胞活力 （A） 和抗氧化酶 CAT （B）、SOD （D） 和 GSH （E） 水平的影响，以及 MDA 的含量 （C）。H2O2代表模型组，VC （抗坏血酸） 为阳性组，其中 25 、 12.5 和 6.25 的值代表 12 个不同浓度的处理组。结果来自三次运行中的代表性实验，显示出相似的模式。与对照组 （P < 0.001） 和模型组 （P < 0.001） 相比差异显著。###***
2.4 化合物12通过流式细胞术分析抑制HepG2细胞中ROS的产生
为了研究化合物12是否通过降低活性氧（ROS）含量来发挥其抗氧化能力，使用流式细胞术测定了HepG2细胞中的ROS含量。结果显示，化合物12在12.5–50 μM浓度下能够降低HepG2细胞中的ROS含量，并在25和12.5 μM浓度下显著改善了HepG2细胞的氧化应激。结果表明，化合物12能够抑制H2O2诱导的HepG2细胞中ROS的产生，从而减少细胞内的氧化应激并防止细胞损伤。
图 10. 流式细胞术评价化合物 12 对 H 中 ROS 含量影响的结果2O2−诱导浓度为 50、25 和 12.5 μM 的 HepG2 细胞;横轴表示荧光强度，纵轴表示收集的细胞数 （A）。H2O2代表模型组，VC （抗坏血酸） 为阳性组，值 50 、 25 和 12.5 代表不同浓度 （A 和 B） 的 12 个处理组。与对照组 （P < 0.001） 和模型组 （*P < 0.1，P < 0.001） 相比显著 不同。###***
2.5 化合物12通过激活Nrf-2通路改善氧化应激
据报道，SLs可以通过抑制TRXRI/Nrf-2信号通路诱导ROS的产生。Nrf-2是一种存在于细胞质中的应激反应转录因子。在氧化应激条件下，Nrf-2从Keap-1解离并转移到细胞核，通过激活抗氧化反应元件（ARE）通路促进应激抵抗基因（编码γ-GCS、GSH-Px、NQO-1和HO-1）的诱导。因此，这些SLs的有益作用的一个重要机制可能与通过Nrf-2/ARE激活增加内源性抗氧化剂有关。
为了进一步探索化合物12通过抗氧化活性防止细胞损伤的机制，测定了Nrf-2在mRNA和蛋白质水平的表达。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，模型组中Nrf-2 mRNA表达显著下调，而化合物12在6.25–25 μM浓度下显著逆转了H2O2诱导的Nrf-2 mRNA下调。Western blot分析显示，与H2O2诱导的模型组相比，化合物12处理显著增加了总Nrf-2和核Nrf-2的水平，而β-actin和Lamin A/C的表达没有变化。同时，与H2O2诱导的模型组相比，化合物12在6.25–25 μM浓度下下调了细胞质中Nrf-2的表达。Nrf-2的核/细胞质比是Nrf-2/ARE通路内在机制的一个指标。由于化合物12增加了HepG2细胞中的这一比例，表明化合物12促进了Nrf-2从细胞质向细胞核的转移。处理后的Nrf-2总水平上调表明化合物12通过稳定和激活Nrf-2增强了抗氧化反应。此外，Nrf-2的下游靶蛋白NQO-1在化合物12处理后表达显著增加。因此，化合物12可以通过激活Nrf-2并促进其从细胞质向细胞核的转移来抵抗细胞氧化应激。
图 11. 化合物 12 通过激活 Nrf-2 通路改善氧化应激。通过 RT-qPCR 分析 mRNA 和 Nrf-2 的表达 （B）。HepG2 细胞中总 Nrf-2 （C）、核 Nrf-2 （D）、胞质 Nrf-2 （E） 和 NQO-1 （G） 表达以及核/胞质 Nrf-2 比值 （F） 的蛋白质印迹分析。显示了三个实验的平均 ± SD。与对照组 （P < 0.001） 和模型组 （P < 0.01，P < 0.001） 相比显著不同。###*****
Conclusions
从天山雪莲的地上部分分离得到了15种SLs（1–15），其中包括11种新化合物sauruintones A-K（1–8和13–15）。值得注意的是，FBMN策略和MS/MS碎片模式大大加速了SLs的发现和注释过程。大多数SLs在12.5–50 μM浓度下表现出增强CAT水平和降低MDA含量的作用。化合物12不仅降低了H2O2诱导的HepG2细胞中的ROS和MDA水平，还逆转了CAT、SOD和GSH的下调。进一步的RT-qPCR和Western blot分析表明，化合物12通过激活Nrf-2通路并促进其转移改善了氧化应激。因此，化合物12有潜力成为细胞抗氧化应激的治疗成分，我们的研究表明SLs可以发挥保护作用，防止细胞氧化应激。化合物12的进一步机制研究和基于MS引导策略的SLs挖掘仍在进行中，结果将在适当时候报告。当前结果为天山雪莲新药和治疗剂的进一步开发提供了科学依据。
作者简介
张于，中国科学院昆明植物研究所，研究员/博士研究生导师，美国北卡罗莱纳大学教堂山分校药学院访问学者，云南省中青年学术和技术带头人、云南省万人计划青年拔尖、中国科学院青年创新促进会会员。主要从事药/食用植物中天然产物结构、活性、作用机制及成药性研究。目前以第一或通讯作者在Organic Letters, Protein&Cell, Journal of Natural Products, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Phytochemistry等权威期刊发表SCI论文70余篇，第一发明人授权发明专利7项；主持国家重点研发计划课题、国家自然科学基金面上、云南省应用基础研究计划重点、中国科学院西部之光等10余项基金，先后获云南省自然科学一等奖和广西自然科学二等奖。
原文网址：https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2024.108067